Kvantifisering av bindingsinteraksjonene mellom Cu (II) og peptidester i nærvær og fravær av kromoforer

Summary

Denne artikkelen fokuserer på bruk av elektronisk absorpsjonsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri for å undersøke og kvantifisere termodynamikken til Cu(II)-binding til peptider og proteiner.

Abstract

Kobber (II) er et essensielt metall i biologiske systemer, som gir unike kjemiske egenskaper til biomolekylene som det samhandler med. Det har blitt rapportert å binde seg direkte til en rekke peptider og spille både nødvendige og patologiske roller som spenner fra medierende struktur til elektronoverføringsegenskaper for å gi katalytisk funksjon. Kvantifisering av bindingsaffiniteten og termodynamikken til disse Cu(II)-peptidkompleksene in vitro gir innsikt i den termodynamiske drivkraften til binding, potensielle konkurranser mellom forskjellige metallioner for peptidet eller mellom forskjellige peptider for Cu(II), og utbredelsen av Cu(II)-peptidkomplekset in vivo. Kvantifisering av bindingstermodynamikken kan imidlertid være utfordrende på grunn av en myriade av faktorer, inkludert å ta hensyn til alle konkurrerende likevekter i et titreringseksperiment, spesielt i tilfeller der det mangler diskrete spektroskopiske håndtak som representerer peptidet, d-blokkmetallionet og deres interaksjoner.

Her er et robust sett med eksperimenter gitt for nøyaktig kvantifisering av Cu (II) -peptid termodynamikk. Denne artikkelen fokuserer på bruk av elektronisk absorpsjonsspektroskopi i nærvær og fravær av kromoforiske ligander for å gi det nødvendige spektroskopiske håndtaket på Cu (II) og bruken av etikettfri isotermisk titreringskalorimetri. I begge eksperimentelle teknikker beskrives en prosess for å redegjøre for alle konkurrerende likevekter. Mens fokuset i denne artikkelen er på Cu (II), kan det beskrevne settet av eksperimenter gjelde utover Cu (II) -peptidinteraksjoner, og gi et rammeverk for nøyaktig kvantifisering av andre metallpeptidsystemer under fysiologisk relevante forhold.

Introduction

Biologi har utviklet seg til å utnytte den mangfoldige kjemien til metallioner som trengs for at livet skal tilpasse seg og overleve i omgivelsene. Anslagsvis 25% -50% av proteiner bruker metallioner for struktur og funksjon¹. Den spesielle rollen og redokstilstanden til metallionen er direkte relatert til sammensetningen og geometrien til de biologiske ligandene som koordinerer den. I tillegg må redoksaktive metallioner som Cu (II) reguleres tett slik at de ikke interagerer med oksidasjonsmidler via Fenton-lignende kjemi for å danne reaktive oksygenarter (ROS) ^2,3,4. Å forstå bindingsmodusene og affiniteten som driver biokjemien, bør bidra til å belyse metallionets biologiske rolle.

Mange teknikker brukes til å studere bindingsinteraksjonene mellom metaller og peptider. Disse er for det meste spektroskopiske teknikker, men inkluderer også datasimuleringer ved hjelp av molekylær dynamikk, sett gjennom Cu (II) interaksjoner med et fragment av amyloid beta (Aβ) ⁵. En mye brukt spektroskopisk teknikk som er tilgjengelig for mange universiteter er kjernemagnetisk resonans (NMR). Ved å bruke den paramagnetiske naturen til Cu (II), kunne Gaggelli og medarbeidere vise hvor metallionet binder seg på et petide gjennom avslapning av nærliggende kjerner⁶. Elektronparamagnetisk resonans (EPR) kan også benyttes til å undersøke plasseringen og modusen til den paramagnetiske^{metallionbindingen 7}. Andre spektroskopiske teknikker som sirkulær dikroisme (CD) kan beskrive koordinasjonen om Cu(II) i systemer som tripeptidsystemer⁸, og massespektrometri kan vise støkiometri og hvilke rester metallionet koordineres gjennom fragmenteringsmønstre ^9,10.

Noen av disse teknikkene, som NMR, er etikettfrie, men krever store konsentrasjoner av peptid, noe som gir utfordringer for studier. En annen vanlig teknikk kalt fluorescensspektroskopi har blitt brukt til å relatere posisjonen til en tyrosin eller tryptofan med slukking fra en Cu (II) ^11,12. På samme måte kan denne teknikken vise strukturelle endringer som følge av Cu (II) binding¹³. Utfordringer med disse metallpeptidbindingsstudiene er imidlertid at de undersøker kromoforaminosyrer som tyrosin som ikke alle systemer har, at metallionet binder seg under en klassisk modell, og at teknikken kanskje ikke bidrar under fysiologiske forhold. Faktisk dukker det opp flere peptider som ikke inneholder slike kromoforaminosyrer eller binder seg under klassiske modeller, og utelukker bruken av disse teknikkene^14,15. Denne artikkelen beskriver tilnærminger for å vurdere bindingsegenskaper i disse scenariene under fysiologisk relevante forhold.

Biologiske ligander kan vedta forskjellige protoneringstilstander som kan påvirke metallionbinding som imidazolringen på histidin. Hvis pH ikke opprettholdes konsekvent, kan resultatene være innviklede eller motstridende. Av denne grunn er buffere en viktig komponent i studiet av metall-protein / peptid-interaksjoner. Imidlertid har mange buffere vist seg å samhandle gunstig med metallioner^16,17. I tillegg til å konkurrere med det biologiske molekylet av interesse, kan bufferen ha lignende koordinerende atomer som kan være vanskelig å skille fra de koordinerende atomene i peptidet eller proteinet. I denne studien fokuseres det på elektronisk absorpsjonsspektroskopi og isotermisk titreringskalorimetri (ITC) som to komplementære teknikker for å studere Cu(II)-peptidinteraksjoner, med spesielle hensyn til buffervalg.

Elektronisk absorpsjonsspektroskopi er en rask, allment tilgjengelig teknikk for å studere metallbindende interaksjoner. Bestråling med lys i ultrafiolette (UV) eller synlige bølgelengder kan føre til absorpsjon av metallsentrerte d-d-bånd, som gir verdifull informasjon om ligandklassifisering, metallgeometrier og tilsynelatende bindingsaffiniteter ^18,19. For disse kompleksene kan direkte titreringer av metallioner til protein- eller peptidløsninger kvantifisere bindende støkiometrier og tilsynelatende bindingsaffiniteter. I noen tilfeller, for eksempel d⁵ eller d¹⁰ elektronkonfigurasjoner, absorberer komplekset ikke lys (dvs. er spektroskopisk stille). I disse spektroskopisk stille overgangsmetallkompleksene kan disse begrensningene omgås ved å bruke en konkurrerende ligand som ved koordinering til metallionet gir detekterbare ladningsoverføringsbånd. I begge tilfeller er denne tilnærmingen begrenset til å kvantifisere bare støkiometri og tilsynelatende bindingsaffinitet, og ingen innsikt i bindende entalpi er gitt uten tilnærminger.

Komplementerende informasjon hentet fra elektronisk absorpsjonsspektroskopi, er ITC en attraktiv teknikk for direkte og streng kvantifisering av bindingsentalpien²⁰. ITC måler direkte varmen som frigjøres eller forbrukes under en bindingshendelse, og siden titrering skjer ved konstant trykk, er den målte varmen entalpien til alle likevekter (ΔH_ITC). I tillegg kvantifiseres støkiometrien til bindingshendelsen (n) og den tilsynelatende bindingsaffiniteten (K_ITC). Fra disse parametrene bestemmes fri energi (ΔG_ITC) og entropi (ΔS_ITC), noe som gir et termodynamisk øyeblikksbilde av bindingshendelsen. Siden det ikke er avhengig av lysabsorpsjon, er ITC en ideell teknikk for spektroskopisk stille arter, for eksempel d⁵ eller d¹⁰ metallionkomplekser. Siden kalorimetri måler varme, kan imidlertid eventuelle uovertrufne buffersystemer og ikke-regnskapsførte likevekter påvirke analysen negativt for å nøyaktig bestemme metallionbindende termodynamikk, og det må utvises stor forsiktighet for å løse disse faktorene²⁰. Hvis itc utføres med riktig strenghet, er itc en robust teknikk for å bestemme termodynamikken til metallprotein/peptidkomplekser.

Her brukes et kromoforisk stille kobberbindende peptid, C-peptid, for å demonstrere komplementær bruk av de to teknikkene. C-peptid er et 31 rester spaltningsprodukt (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) dannet under insulinmodning; den mangler kromoforrester, men har vist seg å binde Cu(II) med fysiologisk relevant affinitet^14,15. Cu(II)-bindingsstedet består av sidekjedene til et glutamat og et aspartat samt N-enden av peptidet^14,15. Disse koordinerende atomene ligner på mange vanlige bufrede systemer. Her vises tandembruken av d-d- og ladningsoverføringsbåndene i elektronisk absorpsjonsspektroskopi og ITC for å kvantifisere Cu (II) bindende termodynamikk til C-peptid. Tilnærmingen fra å studere Cu (II) binding til C-peptid kan brukes på andre metallioner og protein / peptid systemer.

Protocol

1. Elektronisk absorpsjonsspektroskopi: direkte titrering med bufferkonkurranse Prøve forberedelse Forbered en bufret løsning av 50 mM 2-[bis(2-hydroksyetyl)amino]-2-(hydroksymetyl)propan-1,3-diol (bisTris) ved pH 7.4 ved bruk av ultrarent vann (>18 MΩ motstand). Fjern spormetallioner ved å inkubere med en høyaffinitetsharpiks i minst 2 timer med påfølgende filtrering. Løs opp eller fortynn en kjent mengde av peptidet i den metallfrie bufferen.MERK: Ved overvåkin…

Representative Results

Målet var å kvantifisere og bekrefte termodynamikken til Cu (II) binding til C-peptid ved hjelp av komplementære teknikker for elektronisk absorpsjonsspektroskopi og ITC. På grunn av den robuste karakteren av elektronisk absorpsjonsspektroskopi ble det utført en direkte titrering av Cu(II) til 300 μM C-peptid (figur 1). Tilsetning av 150 μM Cu (II) forårsaket en umiddelbar økning i båndet ved 600 nm, tilskrevet d-d-båndet til Cu (II), og fortsatte å øke til 300 μM Cu (II) ble t…

Discussion

Denne artikkelen gir en robust metode for å kvantifisere affiniteten og termodynamikken til Cu(II)-bindingen til peptider. Komplekser med Cu (II) er ideelt egnet til å overvåke d-d absorpsjonsbåndet på metallstedet på grunn av sin d⁹ elektronkonfigurasjon. Selv om ekstinksjonskoeffisienten er liten, og dermed krever større konsentrasjoner av komplekset for å gi et pålitelig signal, kan titreringer av Cu(II) til peptid raskt gi innsikt i bindende støkiometri og omtrentlig bindingsaffinitet. Det kan im…

Materials

1,10-phenanthroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris buffer	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane	Nalgene	296-4545	Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer	Varian	Cary 5000	Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin	Sigma Aldrich	C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Low Volume
ITC analysis software	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software	TA Instruments	ITCRun
light-duty delicate wiper	Kimwipe	34155
loading syringe	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer	Alfa Aesar	A12914
spectrophotometer software	Cary	WinUV Scan
spreadsheet program	Microsoft	Excel	Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe	TA Instruments	5346
ultrapure water	Millipore Sigma	Milli-Q	Any water is okay as long as >18 MΩ resistance