Cuantificación de las interacciones de unión entre cu(II) y residuos peptídicos en presencia y ausencia de cromóforos

Summary

Este artículo se centra en el uso de la espectroscopia de absorción electrónica y la calorimetría de titulación isotérmica para sondear y cuantificar la termodinámica de la unión de Cu(II) a péptidos y proteínas.

Abstract

El cobre (II) es un metal esencial en los sistemas biológicos, que confiere propiedades químicas únicas a las biomoléculas con las que interactúa. Se ha informado que se une directamente a una variedad de péptidos y desempeña funciones necesarias y patológicas que van desde la estructura mediadora hasta las propiedades de transferencia de electrones y la impartición de funciones catalíticas. La cuantificación de la afinidad de unión y la termodinámica de estos complejos de péptidos Cu(II) in vitro proporciona información sobre la fuerza impulsora termodinámica de unión, las competencias potenciales entre diferentes iones metálicos para el péptido o entre diferentes péptidos para Cu(II), y la prevalencia del complejo Cu(II)-péptido in vivo. Sin embargo, cuantificar la termodinámica de unión puede ser un desafío debido a una miríada de factores, incluida la contabilidad de todos los equilibrios competitivos dentro de un experimento de titulación, especialmente en los casos en que hay una falta de mangos espectroscópicos discretos que representen el péptido, el ion metálico del bloque d y sus interacciones.

Aquí, se proporciona un conjunto robusto de experimentos para la cuantificación precisa de la termodinámica del péptido Cu(II). Este artículo se centra en el uso de la espectroscopia de absorción electrónica en presencia y ausencia de ligandos cromofóricos para proporcionar el mango espectroscópico necesario en Cu(II) y el uso de calorimetría de titulación isotérmica sin etiquetas. En ambas técnicas experimentales, se describe un proceso para dar cuenta de todos los equilibrios en competencia. Si bien el enfoque de este artículo se centra en Cu (II), el conjunto descrito de experimentos puede aplicarse más allá de las interacciones Cu (II) -péptido, y proporcionar un marco para la cuantificación precisa de otros sistemas metal-péptido en condiciones fisiológicamente relevantes.

Introduction

La biología ha evolucionado para utilizar la diversa química de los iones metálicos necesarios para que la vida se adapte y sobreviva en su entorno circundante. Se estima que entre el 25% y el 50% de las proteínas utilizan iones metálicos para la estructura y la función¹. El papel particular y el estado redox del ion metálico está directamente relacionado con la composición y la geometría de los ligandos biológicos que lo coordinan. Además, los iones metálicos redox-activos como Cu(II) deben estar estrechamente regulados para que no interactúen con agentes oxidantes a través de la química similar a Fenton para formar especies reactivas de oxígeno (ROS)^2,3,4. Comprender los modos de unión y la afinidad que impulsan su bioquímica debería ayudar a dilucidar el papel biológico del ion metálico.

Muchas técnicas se utilizan para estudiar las interacciones de unión de metales y péptidos. Estas son en su mayoría técnicas espectroscópicas, pero también incluyen simulaciones por computadora utilizando dinámica molecular, como se ve a través de las interacciones Cu(II) con un fragmento de beta amiloide (Aβ)⁵. Una técnica espectroscópica ampliamente utilizada que es accesible para muchas universidades es la resonancia magnética nuclear (RMN). Utilizando la naturaleza paramagnética de Cu(II), Gaggelli et al. pudieron mostrar dónde se une el ion metálico en un pecíolo a través de la relajación de los núcleos cercanos⁶. La resonancia paramagnética electrónica (EPR) también se puede utilizar para sondear la ubicación y el modo de la unión de iones metálicos paramagnéticos⁷. Otras técnicas espectroscópicas como el dicroísmo circular (CD) pueden describir la coordinación sobre Cu(II) en sistemas como los sistemas tripéptidos⁸, y la espectrometría de masas puede mostrar estequiometría y a qué residuos se coordina el ion metálico a través de patrones de fragmentación ^9,10.

Algunas de estas técnicas, como la RMN, no contienen etiquetas, pero requieren grandes concentraciones de péptidos, lo que plantea desafíos para el estudio. Otra técnica común llamada espectroscopia de fluorescencia se ha utilizado para relacionar la posición de una tirosina o triptófano con el enfriamiento de un Cu(II)^11,12. Del mismo modo, esta técnica puede mostrar cambios estructurales como resultado de la unión Cu(II)¹³. Sin embargo, los desafíos con estos estudios de unión metal-péptido son que sondean aminoácidos cromofóricos como la tirosina que no todos los sistemas tienen, que el ion metálico se une bajo un modelo clásico y que la técnica puede no ser propicia en condiciones fisiológicas. De hecho, están surgiendo varios péptidos que no contienen tales aminoácidos cromofóricos ni se unen bajo modelos clásicos, lo que impide el uso de estas técnicas^14,15. Este artículo detalla los enfoques para evaluar las propiedades de unión en estos escenarios en condiciones fisiológicamente relevantes.

Los ligandos biológicos pueden adoptar diferentes estados de protonación que pueden afectar la unión de iones metálicos, como el anillo de imidazol en la histidina. Si el pH no se mantiene de manera consistente, los resultados pueden ser enrevesados o contradictorios. Por esta razón, los tampones son un componente esencial en el estudio de las interacciones metal-proteína/péptido. Sin embargo, se ha demostrado que muchos tampones interactúan favorablemente con los iones metálicos^16,17. Además de competir con la molécula biológica de interés, el tampón puede tener átomos de coordinación similares que pueden ser difíciles de distinguir de los átomos coordinadores del péptido o proteína. En este estudio, la atención se centra en la espectroscopia de absorción electrónica y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) como dos técnicas complementarias para estudiar las interacciones Cu(II)-péptido, con consideraciones especiales sobre la elección del tampón.

La espectroscopia de absorción electrónica es una técnica rápida y ampliamente accesible para estudiar las interacciones de unión a metales. La irradiación con luz en las longitudes de onda ultravioleta (UV) o visible puede conducir a la absorción de bandas d-d centradas en el metal, que proporcionan información valiosa sobre la clasificación de ligandos, las geometrías de los metales y las afinidades de unión^{aparentes 18,19}. Para estos complejos, las valoraciones directas de iones metálicos en soluciones proteicas o peptídicas pueden cuantificar las estequiometrías de unión y las afinidades de unión aparentes. En algunos casos, como las configuraciones de electrones d⁵ o d¹⁰, el complejo no absorbe la luz (es decir, es espectroscópicamente silencioso). En estos complejos de metales de transición espectroscópicamente silenciosos, estas limitaciones se pueden eludir mediante el uso de un ligando competidor que, al coordinarse con el ion metálico, produce bandas de transferencia de carga detectables. En cualquier caso, este enfoque se limita a cuantificar solo la estequiometría y la afinidad de unión aparente, y no se proporciona información sobre la entalpía de unión sin aproximaciones.

Complementando la información obtenida de la espectroscopia electrónica de absorción, el ITC es una técnica atractiva para la cuantificación directa y rigurosa de la entalpía de unión²⁰. ItC mide directamente el calor liberado o consumido durante un evento de unión y, dado que la titulación tiene lugar a presión constante, el calor medido es la entalpía de todos los equilibrios (ΔH_ITC). Además, se cuantifican la estequiometría del evento de unión (n) y la afinidad de unión aparente (K_ITC). A partir de estos parámetros, se determinan la energía libre (ΔG_ITC) y la entropía (ΔS_ITC), proporcionando una instantánea termodinámica del evento de unión. Como no depende de la absorción de luz, itC es una técnica ideal para especies espectroscópicamente silenciosas, por ejemplo, complejos de iones metálicos d⁵ o d¹⁰ . Sin embargo, dado que la calorimetría mide el calor, cualquier sistema tampón sin igual y equilibrios no contabilizados puede afectar negativamente el análisis para determinar con precisión la termodinámica de unión a iones metálicos, y se debe tener mucho cuidado para abordar estos factores²⁰. Si se realiza con el rigor adecuado, el ITC es una técnica robusta para determinar la termodinámica de los complejos metal-proteína/péptido.

Aquí, se utiliza un péptido de unión al cobre cromofóricamente silencioso, el péptido C, para demostrar el uso complementario de las dos técnicas. El péptido C es un producto de escisión de 31 residuos (EAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQ) formado durante la maduración de la insulina; carece de residuos cromofóricos, pero se ha demostrado que se une a Cu(II) con afinidad fisiológicamente relevante^14,15. El sitio de unión de Cu(II) consiste en las cadenas laterales de un glutamato y un aspartato, así como el N-terminal del péptido^14,15. Estos átomos de coordinación se parecen mucho a los de muchos sistemas amortiguados de uso común. Aquí, se muestra el uso en tándem de las bandas d-d y de transferencia de carga en la espectroscopia de absorción electrónica y el ITC en la cuantificación de la termodinámica de unión de Cu(II) al péptido C. El enfoque del estudio de la unión de Cu(II) al péptido C se puede aplicar a otros iones metálicos y sistemas de proteínas/péptidos.

Protocol

1. Espectroscopia de absorción electrónica: titulación directa con competencia tampón Preparación de muestras Preparar una solución tamponada de 50 mM 2-[bis(2-hidroxietil)amino]-2-(hidroximetil)propano-1,3-diol (bisTris) a pH 7,4 utilizando agua ultrapura (resistencia >18 MΩ). Elimine los iones de metales traza incubando con una resina de alta afinidad durante al menos 2 h con la filtración posterior. Disolver o diluir una cantidad conocida del péptido en el tampón…

Representative Results

El objetivo fue cuantificar y corroborar la termodinámica de la unión de Cu(II) al péptido C utilizando las técnicas complementarias de espectroscopia de absorción electrónica e ITC. Debido a la naturaleza robusta de la espectroscopia de absorción electrónica, se realizó una titulación directa de Cu(II) en péptido C de 300 μM (Figura 1). La adición de 150 μM de Cu(II) causó un aumento inmediato en la banda a 600 nm, atribuido a la banda d-d de Cu(II), y continuó aumentando ha…

Discussion

Este artículo proporciona un método robusto para cuantificar la afinidad y la termodinámica de la unión de Cu(II) a los péptidos. Los complejos con Cu(II) son ideales para monitorear la banda de absorción d-d en el sitio del metal debido a su configuración de electrones d⁹ . Aunque el coeficiente de extinción es pequeño, por lo que requiere mayores concentraciones del complejo para producir una señal confiable, las valoraciones de Cu (II) en péptido pueden proporcionar rápidamente información sobr…

Materials

1,10-phenanthroline	Sigma Aldrich	131377-25G
bis-Tris buffer	Fisher	BP301-100
Bottle-top 0.45 micron membrane	Nalgene	296-4545	Any filtration system that removes the resin without introducing contaminants is acceptable
Copper(II) chloride	Alfa Aesar	12458
EDTA	Sigma Aldrich	EDS-500G
Electronic absorption spectrophotometer	Varian	Cary 5000	Another suitable sensitive spectrophotometer is acceptable
high affinity resin	Sigma Aldrich	C7901-25G
Isothermal titration calorimeter (ITC)	TA Instruments	Nano ITC Low Volume
ITC analysis software	TA Instruments	NanoAnalyze	SEDPHAT (Methods. 2015, 76: 137–148) may also be used
ITC software	TA Instruments	ITCRun
light-duty delicate wiper	Kimwipe	34155
loading syringe	Hamilton	Syr 500 uL, 1750 TLL-SAL
matched cuvettes	Starna Cells, Inc	16.100-Q-10/Z20	Ensure that the window for the small volume cuvette matches the beam height of the spectrophotometer
MOPS buffer	Alfa Aesar	A12914
spectrophotometer software	Cary	WinUV Scan
spreadsheet program	Microsoft	Excel	Any suitable spreadsheet program will work
titration syringe	TA Instruments	5346
ultrapure water	Millipore Sigma	Milli-Q	Any water is okay as long as >18 MΩ resistance