Den nåværende protokollen beskriver og sammenligner prosedyren for å utføre en full-region eller sub-region av interesse analyse av sagittal mus hjerne seksjoner for å kvantifisere amyloid-beta belastning i APP / PS1 transgene musemodell av Alzheimers sykdom.
Ekstracellulær akkumulering av amyloid-beta (Aβ) plakk er et av de viktigste patologiske kjennetegnene ved Alzheimers sykdom (AD), og er målet for den eneste FDA-godkjente sykdomsmodifiserende behandlingen for AD. Følgelig brukes bruken av transgene musemodeller som overekspresserer amyloidforløperproteinet og dermed akkumulerer cerebral Aβ-plakk, mye brukt til å modellere menneskelig AD hos mus. Derfor måler immunoassays, inkludert enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og immunostaining, vanligvis Aβ-belastningen i hjernevev avledet fra AD-transgene mus. Selv om metodene for Aβ-deteksjon og kvantifisering er godt etablert og dokumentert, er det ikke rapportert effekten av størrelsen på interesseområdet som er valgt i hjernevevet på Aβ-belastningsmålinger etter immunstaining. Derfor hadde den nåværende protokollen som mål å sammenligne Aβ-belastningsmålingene på tvers av full- og underregioner av interesse ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare. Trinnene som er involvert i hjernevevsforberedelse, frittflytende hjerneseksjonsimmunisering, avbildning og kvantifisering av Aβ-belastning i full- versus underregioner av interesse, beskrives ved hjelp av hjerneseksjoner avledet fra 13 måneder gamle APP / PS1 doble transgene mannlige mus. Den nåværende protokollen og resultatene gir verdifull informasjon om virkningen av størrelsen på interesseområdet på Aβ-positiv område kvantifisering, og viser en sterk sammenheng mellom det Aβ-positive området oppnådd ved hjelp av full- og underregioner av interesseanalyser for hjerneseksjoner avledet fra 13 måneder gamle mannlige APP / PS1 mus som viser utbredt Aβ-avsetning.
Alzheimers sykdom (AD), den sjette ledende dødsårsaken i USA, fortsetter å være en folkehelsetrussel, med anslagsvis 6,2 millioner amerikanere som bor med AD. Dette forventes å nå 13,8 millioner innen 20601. Til dags dato er symptomatisk styring gjennom medisiner som kolinsterasehemmere og memantin det primære behandlingsforløpet2. AD er preget av nevropaologiske manifestasjoner som ekstracellulær avsetning av amyloid-beta (Aβ) plakk og intracellulær hyperfosforylert tau akkumulering i form av nevrofibrillære tangles 3,4. Formet av en endoproteolytisk spalting av amyloid forløperproteinet (APP) via beta- og gamma-secretase, aggregerer Aβ for å danne oligomerer og fibrils, noe som fører til nevrotoksiske effekter5. Aβ har blitt hypoteset til å tjene en primær patologisk rolle siden 1980-tallet, og er det terapeutiske målet for den eneste FDA-godkjente sykdomsmodifiserende behandlingen for6. Som et resultat har transgene AD-musemodeller med mutasjoner i gener som resulterer i robust cerebral Aβ-akkumulering blitt mye brukt til preklinisk AD-forskning siden tidlig på 1990-tallet7.
Påvisning av Aβ-arter i disse AD-transgene musehjernene gjøres vanligvis ved hjelp av to immunoassays: enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) og immunstaining. Den tidligere analysen muliggjør kvantitativ bestemmelse av forskjellige Aβ-arter og er mindre tidkrevende sammenlignet med immunoppnåelse, noe som krever flere sekvensielle vevsbehandlings- og bildetrinn, inkludert vevsseksjon, immunostaining, avbildning og kvantifisering8. Videre er resultatene oppnådd etter immunstainingsemi-kvantitative 8. Evnen til å lokalisere Aβ gjør imidlertid immunstaining til en attraktiv tilnærming for Aβ-deteksjon i hjernevev8.
Ved bruk av Aβ-immunostaining har flere ulike kvantifiseringsparadigmer blitt brukt av ulike forskningsgrupper. For eksempel kvantifiserer noen forskningsgrupper Aβ-belastningen i hele interesseområdet (cortex eller hippocampus), mens andre kvantifiserer Aβ-belastningen i en spesifisert underregion av interesse (en del av cortex eller hippocampus)9,10,11. Selv om metodene for Aβ-deteksjon og kvantifisering er godt etablert og dokumentert, er det ikke rapportert effekten av størrelsen på interesseområdet på Aβ-belastningsmålinger etter immunstaining. Derfor hadde den nåværende protokollen som mål å sammenligne Aβ-belastningsmålingene på tvers av full- og underregioner av interesse ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare, ImageJ.
Den nåværende studien brukte 13 måneder gamle APP/ PS1 doble transgene hannmus, som uttrykker en chimerisk mus / menneskelig APP og en mutant presenilin 1, for å modellere tidlig start på12 e.Kr. Aβ-forekomster begynner å utvikle seg med 6-7 måneder, og rikelig Aβ-akkumulering observeres både i cortex og hippocampus av disse musene med 9-10 måneder i alderen12. De transgene amyloidpeptider og holoprotein kan påvises ved 6E10-immunostaining13, noe som gjør det til en ønskelig dyremodell for den nåværende protokollen. Prosedyren som dekkes her inkluderer hjernevevsforberedelse, immunisering av frittflytende seksjoner, avbildning og kvantifisering av Aβ-belastning i full- versus underregioner av interesse. Analysen viser en sterk sammenheng mellom full- og subregionsk kvantifisering, noe som indikerer robust enighet mellom disse to metodene i hjernevevsseksjonene avledet fra 13 måneder gamle APP / PS1 mannlige mus som viser rikelig Aβ-forekomster.
Protokollen som er beskrevet her, skisserer prosedyren for hemi-hjerneforberedelse for sagittal seksjonering, immunfluorescerende farging av Aβ-avsetninger ved hjelp av 6E10-antistoffet på frittflytende seksjoner, avbildning av Aβ-fargede hjerneseksjoner etterfulgt av kvantifisering av Aβ-forekomstene i cortex og hippocampus av musehjernevev ved hjelp av en bildeanalyseprogramvare. Mens det er publiserte protokoller for å kvantifisere Aβ-belastning i hjernevevsseksjoner 8,10, beskriver denne protokollen trinnene som er involvert i kvantifiseringen av Aβ-belastning i hele iso-cortex (referert til som cortex) og hippocampus i forhold til Aβ-belastningen i en underregion av interesse for cortex og hippocampus, når dette kan være ønsket. Sammenhengen mellom full- og underregioner av interesseanalyser er også gitt.
Det er flere kritiske trinn i protokollen. For det første er protokollen som er beskrevet for 20 μm tykke hjernevevsseksjoner utsatt for frittflytende immunostaining, noe som resulterer i optimal antistoffinntrengning i vevet avsnitt18. Den frittflytende teknikken kan kreve at vevsdelene overføres manuelt mellom de forskjellige løsningene under immunfluorescerende farging, og forsiktig håndtering av vevsdelene gjennom hele prosedyren. Dette er spesielt viktig når vevsseksjonene er nedsenket i 70% maursyreoppløsning for antigenuthenting i den nåværende protokollen, noe som øker vevsskjørheten for tynne seksjoner. Alternative tilnærminger til den beskrevne protokollen inkluderer bruk av tykkere vevsseksjoner (f.eks. 30-40 μm) eller bruk av vevsseksjoner som er direkte montert på positivt ladede lysbilder før immunfluorescerende farging. For det andre bruker protokollen som er beskrevet her, et fluorescerende merket 6E10 antistoff. Foruten å bruke fluorescerende merket 6E10 antistoff, kan ikke-fluorescerende 6E10 antistoffer (f.eks. pepperrotperoksidasekonjugert 6E10 antistoff) også brukes til å oppdage Aβ-belastning i hjernevevsseksjoner, og den nåværende protokollen kan tilpasses for å kvantifisere Aβ-positive immunkjemiske flekker i hjernevevseksjonene som beskrevet tidligere8 . For det tredje vil nøyaktigheten av resultatene for Aβ-belastnings kvantifisering avhenge av riktig terskelvalg i analyseprogramvaren, som er avhengig av vevsbakgrunnen og signalintensiteten. Terskelvalg må utføres av sluttbrukeren slik at bare Aβ-positive flekker velges for kvantifisering. Sluttbrukerintervensjon kreves for å optimalisere den spesifikke terskelen som kan brukes på alle bildene for å sikre nøyaktigheten av terskelinnstillingen. For det fjerde, siden underregionen av interesseanalyse krever valg av en liten interesseregion i vevsdelen, ble to uavhengige lesere brukt til denne analysen. For å opprettholde uavhengighet og blinding under datainnsamlingen, ble alle bildene nummerert kodet; Bildeanalysesekvensen ble randomisert mellom leserne slik at de forskjellige leserne analyserte forskjellige bilder til enhver tid, og dataene ble sendt inn på slutten av hver uke. På grunn av den økte sannsynligheten for variasjon mellom lesere i regionen av interessevalg i underregionen av interesseanalyse, ble leserne opplært ved hjelp av flere prøvebilder for å optimalisere regionvalget i cortex og hippocampus før de begynte datainnsamlingen. Denne opplæringen er avgjørende for å redusere variasjon mellom lesere, og som det fremgår (figur 5A,B), viser det 6E10-positive området rapportert av begge leserne en sterk relativ avtale i den nåværende studien.
Den nåværende protokollen og resultatene gir verdifull informasjon om virkningen av regionen av interessestørrelse på Aβ-positiv område kvantifisering. En større interesseregion forventes å representere vevet mer enn en mindre interesseregion. Derfor er prøvetaking av et større vev ønskelig å nøyaktig kvantifisere Aβ-belastningen i vev. Men når det gjelder homogen Aβ-belastningsfordeling i vevet, anses en mindre prøvetakingsregion generelt som en god representasjon av det større vevet som analyseres. De nåværende studieresultatene bekrefter dette, og Aβ-belastningen i hele cortex og hippocampus var en sterk korrelasjon av Aβ-belastning i en valgt underregion av cortex og hippocampus (figur 5C, D). For ytterligere å bekrefte avtalen mellom de fulle og underregionene av interesseanalyser, ble det gjennomsnittlige 6E10-positive området i cortex og hippocampus sammenlignet, og ingen forskjell mellom de to metodene (figur 5E) ble funnet. Dette bekrefter at en av disse metodene (full- eller underregionanalyse) gir sammenlignbare Aβ-belastningsmålinger.
Gjeldende protokoll har noen begrensninger. De to metodene (full-region versus sub-region analyse) kan ikke alltid brukes om hverandre. Valget av å bruke full- eller subregionanalysen vil avhenge av den regionale fordelingen av Aβ i vevet, som påvirkes av alder, kjønn og belastning av AD-musemodellen. På 13 måneder fordeles Aβ-belastningen gjennom cortex og hippocampus av APP / PS1-musene. Men på 6 måneder er Aβ-avsetninger begrenset til cortex, og minimale forekomster observeres i hippocampus12. Under slike forhold kan hele interesseanalysen være ønsket tilnærming for å øke vevsprøvetakingsområdet og dermed Aβ-signalet. På den annen side kan underregionanalyse være den valgte metoden når Aβ-belastning i en bestemt hjerneregion er av interesse(f.eks. den somatosensoriske cortexen). I tillegg, på 13 måneder, viser APP / PS1 mannlige mus intense 6E10-positive flekker, og immunfluorescerende farging resulterer i et utmerket signal med svært lav bakgrunn, noe som gjør den nåværende protokollen svært egnet for kvantifisering under de gitte forholdene. Det er uklart om denne kvantifiseringsmetoden kan brukes med hell på mindre intens farging, og fremtidig arbeid vil bli nødvendig for å svare på dette spørsmålet. Den immunfluoreserende og bilde kvantifiseringsmetoden presentert heri oppdager alle former for Aβ, inkludertforløperformen 13. Som et resultat, hvis det er interesse for påvisning av en bestemt Aβ-spesifikasjon (f.eks. Aβ1-40 eller Aβ1-42), kan antistoffer som er spesifikke for disse Aβ-isoformene brukes. Derfor, selv om 6E10 immunfluorescent fargings- og deteksjonsmetoden korrelert med målingene av Aβ1-42-målinger i helhjerne homogenater ved hjelp av ELISA (figur 5F,G), var korrelasjonen bare beskjeden. Dette kan tilskrives målingen av bare Aβ1-42 ved hjelp av ELISA og påvisning av alle Aβ-arter ved hjelp av 6E10-immunostaining. Den nåværende studien bruker tre lesere til å vurdere avtalen og sammenhengen mellom full- og subregionale analyser. Å ha flere lesere kan forbedre robustheten i studien og kan ytterligere validere avtalene mellom de to metodene som presenteres her. Videre bruker vi Pearson-korrelasjonen som et mål på enighet, som er mye brukt blant andre metoder for å beskrive avtalen mellom kontinuerlige variabler19. En begrensning ved å bruke Pearson-korrelasjonen til å fastslå enighet er imidlertid at de to metodene som brukes her, kan gi relaterte resultater, men en metode kan resultere i generelle høyere verdier enn den andre på grunn av systematiske skjevheter. Derfor er Pearson-korrelasjon et godt mål på relativ avtale19. For å øke robustheten i protokollen kan ytterligere metoder for å bekrefte den absolutte avtalen, for eksempel å sammenligne det gjennomsnittlige 6E10-positive området ved hjelp av de to metodene (figur 5E), brukes19. Samlet sett sammenligner den nåværende protokollen Aβ-belastningen som oppdages av immunfluorescerende farging og analyserer full- og underregioner av interesse for hjernevevsseksjoner. Resultatene viser en sterk sammenheng mellom disse to metodene for hjernevevsseksjoner avledet fra 13 måneder gamle APP / PS1 mannlige mus som viser rikelig Aβ-forekomster.
The authors have nothing to disclose.
Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Institute of Aging of the National Institutes of Health under tildelingsnummer R01AG062840 (til RKS) og R01AG072896 (til RKS). Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health. Omtrent $ 200 000 (100%) av føderale midler støttet dette prosjektet. Vi vil også takke Dr. Joshua Yang for hans hjelp med manuskriptredigering.
15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |