Detta protokoll beskriver och jämför proceduren för att utföra en fullständig region- eller subregion av intresseanalys av sagittala mushjärnsektioner för att kvantifiera amyloid-beta-belastning i APP / PS1 transgen musmodell av Alzheimers sjukdom.
Extracellulär ackumulering av amyloid-beta (Aβ) plack är ett av de viktigaste patologiska kännetecknen för Alzheimers sjukdom (AD), och är målet för den enda FDA-godkända sjukdomsmodifierande behandlingen för AD. Följaktligen används användningen av transgena musmodeller som överuttrycker amyloidprekursorproteinet och därmed ackumulerar cerebrala Aβ-plack i stor utsträckning för att modellera human AD hos möss. Därför mäter immunanalyser, inklusive enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) och immunfärgning, vanligtvis Aβ-belastningen i hjärnvävnader härledda från AD-transgena möss. Även om metoderna för Aβ-detektion och kvantifiering har varit väl etablerade och dokumenterade, har effekten av storleken på det intresseområde som valts i hjärnvävnaden på Aβ-belastningsmätningar efter immunfärgning inte rapporterats. Därför syftade det nuvarande protokollet till att jämföra Aβ-belastningsmätningarna över de fullständiga och delregionerna av intresse med hjälp av en bildanalysprogramvara. Stegen som är involverade i hjärnvävnadsberedning, fritt flytande hjärnsektionsimmunfärgning, avbildning och kvantifiering av Aβ-belastning i full- kontra subregioner av intresse beskrivs med hjälp av hjärnsektioner härledda från 13 månader gamla APP / PS1 dubbeltransgena hanmöss. Det aktuella protokollet och resultaten ger värdefull information om effekten av storleken på regionen av intresse på Aβ-positiv areakvantifiering och visar en stark korrelation mellan det Aβ-positiva området som erhållits med hjälp av full- och delregionerna av intresseanalyser för hjärnsektioner härledda från 13 månader gamla manliga APP / PS1-möss som visar utbredd Aβ-deposition.
Alzheimers sjukdom (AD), den sjätte ledande dödsorsaken i USA, fortsätter att vara ett hot mot folkhälsan, med uppskattningsvis 6.2 miljoner amerikaner som lever med AD. Detta förväntas uppgå till 13,8 miljoner år 20601. Hittills är symptomatisk hantering genom läkemedel som kolinesterashämmare och memantin den primära behandlingsförloppet2. AD kännetecknas av neuropatologiska manifestationer såsom extracellulär avsättning av amyloid-beta (Aβ) plack och intracellulär hyperfosforylerad tau-ackumulering i form av neurofibrillära trassel 3,4. Bildad av endoproteolytisk klyvning av amyloidprekursorproteinet (APP) via beta- och gammasekretas, Aβ-aggregat för att bilda oligomerer och fibriller, vilket leder till neurotoxiska effekter5. Aβ har antagits tjäna en primär patologisk roll sedan 1980-talet och är det terapeutiska målet för den enda FDA-godkända sjukdomsmodifierande terapin för AD6. Som ett resultat har transgena AD-musmodeller som innehåller mutationer i gener som resulterar i robust cerebral Aβ-ackumulering använts i stor utsträckning för preklinisk AD-forskning sedan början av 1990-talet7.
Detektion av Aβ-arter i dessa AD-transgena mushjärnor görs vanligtvis med hjälp av två immunanalyser: enzymbunden immunosorbentanalys (ELISA) och immunfärgning. Den tidigare analysen möjliggör kvantitativ bestämning av olika Aβ-arter och är mindre tidskrävande jämfört med immunfärgning, vilket kräver flera sekventiella vävnadsbehandlings- och avbildningssteg, inklusive vävnadssnitt, immunfärgning, avbildning och kvantifiering8. Vidare är resultaten erhållna efter immunfärgning semikvantitativa8. Förmågan att rumsligt lokalisera Aβ gör emellertid immunfärgning till ett attraktivt tillvägagångssätt för Aβ-detektion i hjärnvävnader8.
Vid användning av Aβ-immunfärgning har flera olika kvantifieringsparadigmer använts av olika forskargrupper. Till exempel kvantifierar vissa forskargrupper Aβ-belastningen i hela regionen av intresse (cortex eller hippocampus), medan andra kvantifierar Aβ-belastningen i en specificerad delregion av intresse (en del av cortex eller hippocampus)9,10,11. Även om metoderna för Aβ-detektion och kvantifiering har varit väl etablerade och dokumenterade, har effekten av storleken på det intressanta området på Aβ-belastningsmätningar efter immunfärgning inte rapporterats. Därför syftade det nuvarande protokollet till att jämföra Aβ-belastningsmätningarna över de fullständiga och delregionerna av intresse med hjälp av en bildanalysprogramvara, ImageJ.
Den aktuella studien använde 13 månader gamla APP / PS1 dubbeltransgena hanmöss, som uttrycker en chimär mus / mänsklig APP och en mutant presenilin 1, för att modellera tidig debut av AD12. Aβ-avlagringar börjar utvecklas vid 6-7 månaders ålder, och riklig Aβ-ackumulering observeras både i cortex och hippocampus hos dessa möss vid 9-10 månaders ålder12. De transgena amyloidpeptiderna och holoproteinet kan detekteras med 6E10-immunfärgning13, vilket gör det till en önskvärd djurmodell för detta protokoll. Förfarandet som behandlas häri inkluderar beredning av hjärnvävnad, immunfärgning av fritt flytande sektioner, avbildning och kvantifiering av Aβ-belastning i full- kontra delregioner av intresse. Analysen visar en stark korrelation mellan den fullständiga och subregionala kvantifieringen, vilket indikerar robust överensstämmelse mellan dessa två metoder i hjärnvävnadssektionerna härledda från 13 månader gamla APP / PS1-hanmöss som visar rikliga Aβ-avlagringar.
Protokollet som beskrivs här beskriver proceduren för hemi-hjärnberedning för sagittal sektionering, immunofluorescerande färgning av Aβ-avlagringar med användning av 6E10-antikroppen på fritt flytande sektioner, avbildning av de Aβ-färgade hjärnsektionerna följt av kvantifiering av Aβ-avlagringarna i cortex och hippocampus av mushjärnvävnad med hjälp av en bildanalysprogramvara. Även om det finns publicerade protokoll för att kvantifiera Aβ-belastning i hjärnvävnadsavsnitt 8,10, beskriver detta protokoll stegen som är involverade i kvantifieringen av Aβ-belastning i hela iso-cortex (kallad cortex) och hippocampus i jämförelse med Aβ-belastningen i en delregion av intresse för cortex och hippocampus, när detta kan önskas. Korrelationen mellan analyserna av hela respektive delregioner av intresse tillhandahålls också.
Det finns flera kritiska steg i protokollet. För det första är det beskrivna protokollet för 20 μm tjocka hjärnvävnadssektioner som utsätts för fritt flytande immunfärgning, vilket resulterar i optimal antikroppspenetration inomvävnadsavsnittet 18. Den fritt flytande tekniken kan kräva att vävnadssektionerna överförs manuellt mellan de olika lösningarna under den immunofluorescerande färgningen och noggrann hantering av vävnadssektionerna under hela proceduren. Detta är särskilt viktigt när vävnadssektionerna är nedsänkta i 70% myrsyralösning för antigenhämtning i det aktuella protokollet, vilket ökar vävnadens bräcklighet för tunna sektioner. Alternativa tillvägagångssätt för det beskrivna protokollet inkluderar användning av tjockare vävnadssektioner (t.ex. 30-40 μm) eller användning av vävnadssektioner som är direkt monterade på positivt laddade objektglas före immunofluorescerande färgning. För det andra använder protokollet som beskrivs häri en fluorescerande märkt 6E10-antikropp. Förutom att använda den fluorescerande märkta 6E10-antikroppen kan icke-fluorescerande 6E10-antikroppar (t.ex. pepparrotsperoxidaskonjugerad 6E10-antikropp) också användas för att detektera Aβ-belastning i hjärnvävnadssektioner, och det nuvarande protokollet kan anpassas för att kvantifiera Aβ-positiva immunokemiska fläckar i hjärnvävnadssektionerna som beskrivits tidigare8 . För det tredje kommer noggrannheten i resultaten för Aβ-belastningskvantifiering att bero på lämpligt tröskelval i analysprogramvaran, vilket är beroende av vävnadsbakgrunden och signalintensiteten. Valet av tröskelvärde skall göras av slutanvändaren så att endast Aβ-positiva fläckar väljs ut för kvantifiering. Slutanvändarens ingripande krävs för att optimera det specifika tröskelvärdet som kan tillämpas på alla bilder för att säkerställa noggrannheten i tröskelinställningen. För det fjärde, eftersom analysen av delregionen av intresse kräver att man väljer en liten region av intresse i vävnadssektionen, användes två oberoende läsare för denna analys. För att upprätthålla oberoende och blindning under datainsamlingen var alla bilder nummerkodade; bildanalyssekvensen randomiserades mellan läsarna så att de olika läsarna analyserade olika bilder vid varje given tidpunkt, och data skickades in i slutet av varje vecka. På grund av den ökade sannolikheten för inter-reader-variabilitet i regionen av intresseval i underregionen av intresseanalys, utbildades läsarna med flera provbilder för att optimera regionval i cortex och hippocampus innan datainsamlingen påbörjades. Denna utbildning är avgörande för att minska variationen mellan läsare, och som framgår (figur 5A,B) visar det 6E10-positiva området som rapporterats av båda läsarna en stark relativ överenskommelse i den aktuella studien.
Det nuvarande protokollet och resultaten ger värdefull information om effekten av regionen av intressestorlek på Aβ-positiv arealkvantifiering. En större region av intresse förväntas representera vävnaden mer än en mindre region av intresse. Därför är provtagning av en större vävnad önskvärt för att exakt kvantifiera Aβ-belastningen i vävnader. Vid homogen Aβ-belastningsfördelning i vävnaden anses emellertid en mindre provtagningsregion i allmänhet vara en bra representation av den större vävnad som analyseras. De aktuella studieresultaten bekräftar detta, och Aβ-belastningen i hela cortex och hippocampus var ett starkt korrelat av Aβ-belastning i en utvald delregion av cortex och hippocampus (Figur 5C, D). För att ytterligare bekräfta överensstämmelsen mellan analyserna av full- och delregioner av intresse jämfördes det genomsnittliga 6E10-positiva området i cortex och hippocampus, och ingen skillnad mellan de två metoderna (figur 5E) hittades. Detta bekräftar att någon av dessa metoder (fullständig eller delregionanalys) ger jämförbara Aβ-belastningsmätningar.
Det nuvarande protokollet har vissa begränsningar. De två metoderna (analys av hela regionen kontra delregionen) kanske inte alltid används omväxlande. Valet att använda hela eller delregionanalysen beror på den regionala fördelningen av Aβ i vävnaden, vilket påverkas av ålder, kön och stam av AD-musmodellen. Vid 13 månader fördelas Aβ-belastningen över cortex och hippocampus hos APP/ PS1-mössen. Men vid 6 månader är Aβ-avlagringar begränsade till cortex, och minimala avlagringar observeras i hippocampus12. Under sådana förhållanden kan analysen av hela regionen av intresse vara det önskade tillvägagångssättet för att öka vävnadsprovtagningsområdet och därmed Aβ-signalen. Å andra sidan kan subregionanalys vara den metod som valts när Aβ-belastning i en specifik hjärnregion är av intresse (t.ex. den somatosensoriska cortexen). Dessutom, vid 13 månader, visar APP / PS1-hanmössen intensiva 6E10-positiva fläckar, och den immunofluorescerande färgningen resulterar i en utmärkt signal med en mycket låg bakgrund, vilket gör det nuvarande protokollet mycket lämpligt för kvantifiering under de givna förhållandena. Det är oklart om denna kvantifieringsmetod kan tillämpas framgångsrikt på mindre intensiv färgning, och framtida arbete kommer att krävas för att svara på denna fråga. Den immunofluorescerande och bildkvantifieringsmetod som presenteras häri detekterar alla former av Aβ, inklusive prekursorformen13. Som ett resultat, om det finns ett intresse för detektion av en specifik Aβ-specie (t.ex. Aβ1-40 eller Aβ1-42), kan antikroppar specifika för dessa Aβ-isoformer användas. Därför, även om 6E10 immunofluorescerande färgnings- och detektionsmetod korrelerade med mätningarna av Aβ1-42-mätningar i homogenater i hela hjärnan med ELISA (figur 5F, G), var korrelationen endast blygsam. Detta kan hänföras till mätningen av endast Aβ1-42 med elisa och detektion av alla Aβ-arter med användning av 6E10-immunfärgningen. I den aktuella studien används tre läsare för att bedöma överensstämmelsen och korrelationen mellan de fullständiga och subregionala analyserna. Att ha ytterligare läsare kan förbättra studiens robusthet och kan ytterligare validera överenskommelserna mellan de två metoderna som presenteras här. Vidare använder vi Pearson-korrelationen som ett mått på överenskommelse, som ofta används bland andra metoder för att beskriva överensstämmelsen mellan kontinuerliga variabler19. En begränsning med att använda Pearson-korrelationen för att bestämma överenskommelse är dock att de två metoderna som används häri kan ge relaterade resultat, men en metod kan resultera i totalt sett högre värden än den andra på grund av systematisk bias. Därför är Pearson-korrelation ett bra mått på relativ överenskommelse19. För att öka protokollets robusthet kan ytterligare metoder för att bekräfta den absoluta överenskommelsen, såsom att jämföra det genomsnittliga 6E10-positiva området med de två metoderna (figur 5E), användas19. Sammantaget jämför det nuvarande protokollet Aβ-belastningen som detekteras genom immunofluorescerande färgning och analyserar de fullständiga och delregionerna av intresse i hjärnvävnadssektioner. Resultaten visar en stark korrelation mellan dessa två metoder för hjärnvävnadssektioner härledda från 13 månader gamla APP / PS1-hanmöss som visar rikliga Aβ-avlagringar.
The authors have nothing to disclose.
Forskning som rapporteras i denna publikation stöddes av National Institute of Aging vid National Institutes of Health under tilldelningsnummer R01AG062840 (till RKS) och R01AG072896 (till RKS). Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis de officiella åsikterna från National Institutes of Health. Cirka $ 200k (100%) av federala medel stödde detta projekt. Vi vill också tacka Dr. Joshua Yang för hans hjälp med manuskriptredigering.
15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |