Deplezione extracellulare di glucosio come misura indiretta dell'assorbimento di glucosio nelle cellule e nei tessuti Ex Vivo

Summary

L’esaurimento extracellulare del glucosio marcato fluorescentemente è correlato all’assorbimento del glucosio e potrebbe essere utilizzato per lo screening ad alto rendimento dell’assorbimento del glucosio negli organi asportati e nelle colture cellulari.

Abstract

L’epidemia mondiale in corso di diabete aumenta la domanda per l’identificazione di fattori ambientali, nutrizionali, endocrini, genetici ed epigenetici che influenzano l’assorbimento del glucosio. La misurazione della fluorescenza intracellulare è un metodo ampiamente utilizzato per testare l’assorbimento di glucosio marcato fluorescentemente (FD-glucosio) nelle cellule in vitro o per l’imaging di tessuti che consumano glucosio in vivo. Questo test valuta l’assorbimento del glucosio in un punto temporale scelto. L’analisi intracellulare presuppone che il metabolismo del glucosio FD sia più lento di quello del glucosio endogeno, che partecipa alle reazioni cataboliche e anaboliche e alla segnalazione. Tuttavia, il metabolismo dinamico del glucosio altera anche i meccanismi di assorbimento, che richiederebbero misurazioni cinetiche dell’assorbimento del glucosio in risposta a diversi fattori. Questo articolo descrive un metodo per misurare l’esaurimento extracellulare di FD-glucosio e convalida la sua correlazione con l’assorbimento intracellulare di FD-glucosio in cellule e tessuti ex vivo. La deplezione extracellulare del glucosio può essere potenzialmente applicabile per studi cinetici e dose-dipendenti ad alto rendimento, nonché per l’identificazione di composti con attività glicemica e dei loro effetti specifici per i tessuti.

Introduction

La domanda di misurazione dell’assorbimento di glucosio aumenta insieme alla necessità critica di affrontare un aumento epidemico di una moltitudine di malattie dipendenti dal metabolismo del glucosio. I meccanismi alla base delle malattie metaboliche degenerative, dei disturbi neurologici e cognitivi¹, delle malattie infiammatorie² e infettive³, del cancro ^4,5, così come dell’invecchiamento⁶, dipendono dal metabolismo del glucosio per l’energia e il suo stoccaggio, i processi anabolici, le proteine e la modificazione genica, la segnalazione, la regolazione dei geni e la sintesi e la replicazione degli acidi nucleici ^7,8,9 . Il diabete mellito (DM) è direttamente correlato al malfunzionamento della regolazione dell’assorbimento del glucosio. La DM è uno spettro di malattie croniche come il diabete mellito di tipo 1, -2 e -3, il diabete gestazionale, il diabete ad esordio maturo dei giovani e altri tipi di questa malattia indotti da fattori ambientali e / o genetici. Nel 2016, il primo rapporto globale dell’OMS sul diabete ha dimostrato che il numero di adulti che vivono con il DM più diffuso è quasi quadruplicato dal 1980 a 422 milioni di adulti¹⁰, e questo numero di pazienti DM è aumentato esponenzialmente negli ultimi decenni. Solo nel 2019, una stima di 1,5 milioni di morti è stata causata direttamente da¹⁰ DM. Questo drammatico aumento è dovuto all’aumento del DM di tipo 2 e alle condizioni che lo guidano, tra cui sovrappeso e obesità¹⁰. La pandemia di COVID-19 ha rivelato un aumento di due volte della mortalità nei pazienti con DM rispetto alla popolazione generale, suggerendo il ruolo profondo ma poco compreso del metabolismo del glucosio nella difesa immunitaria³. La prevenzione, la diagnosi precoce e il trattamento del DM, dell’obesità e di altre malattie richiedono l’ottimizzazione delle misurazioni dell’assorbimento del glucosio da parte di diversi tessuti e l’identificazione dei fattori ambientali¹¹, nutrizionali¹², endocrini¹³,^{genetici 14} ed epigenetici¹⁵ che influenzano l’assorbimento del glucosio.

Nella ricerca, l’assorbimento intracellulare e/o tissutale di glucosio è comunemente misurato da glucosio marcato fluorescentemente (FD-glucosio) in vitro 16,17,18 e in vivo¹⁹. Fd-glucosio è diventato un metodo preferito rispetto a metodi più precisi che utilizzano glucosio²⁰ marcato radioattivamente, analisi analitica di spettroscopia^{di massa 21}, metabolomica²², metodi di risonanza magnetica nucleare²³ e tomografia ad emissione di positroni / tomografia computerizzata (PET / CT) ^5,24. A differenza dell’assorbimento di FD-glucosio, i metodi analitici che richiedono più materiale biologico possono comportare una preparazione del campione in più fasi, strumenti costosi e analisi di dati complessi. Misurazioni efficaci e poco costose dell’assorbimento di glucosio FD in colture cellulari sono state utilizzate in esperimenti proof-of-concept e potrebbero richiedere la convalida con altri metodi.

La base dell’applicazione di FD-glucosio per gli studi sull’assorbimento del glucosio è il ridotto metabolismo del glucosio FD rispetto al glucosio endogeno²⁵. Tuttavia, sia il glucosio endogeno che il glucosio FD sono distribuiti dinamicamente tra tutti i compartimenti cellulari per l’uso nei processi anabolici, catabolici e di segnalazione. La compartimentazione e l’elaborazione dipendente dal tempo²⁵ del glucosio FD interferiscono con le misurazioni di fluorescenza e rappresentano i principali fattori limitanti per l’uso di questo test in esperimenti di screening ad alto rendimento, analisi cinetica, coltura cellulare 3D, co-colture ed esperimenti di espianto tissutale. Qui, forniamo dati che dimostrano un’alta correlazione tra l’esaurimento extracellulare di FD-glucosio e il suo assorbimento intracellulare, suggerendo l’esaurimento extracellulare di FD-glucosio come misura surrogata per l’assorbimento intracellulare di glucosio. La misurazione della deplezione extracellulare del glucosio è stata applicata per convalidare le differenze tessuto-specifiche nell’assorbimento del glucosio nei topi trattati con insulina e un farmaco sperimentale¹⁸ per fornire una prova di principio di questo metodo.

L’attuale protocollo descrive le misurazioni intracellulari ed extracellulari (Figura 1) dell’assorbimento di FD-glucosio nelle cellule 3T3-L1. Le sezioni del protocollo 1-7 spiegano la coltura e la crescita delle cellule per 48 ore; fame cellulare, stimolazione e misurazioni extracellulari di base; e misure post-stimolazione di FD-glucosio extracellulare e misurazioni intracellulari di FD-glucosio e proteine. La sezione 8 del protocollo descrive la misurazione ex vivo dell’assorbimento extracellulare di FD-glucosio in tessuti sezionati da topi ob/ob in presenza e assenza di insulina e composto di aminoacidi 2 (AAC2) descritti altrove¹⁸.

Protocol

Gli studi sugli animali sono stati approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee della Ohio State University (OSU, protocollo 2007A0262-R4). NOTA: Tutte le procedure devono essere eseguite in un armadio di biosicurezza di classe II con il ventilatore acceso e le luci spente. 1. Preparazione dei materiali NOTA: Tutti i materiali sono elencati nella Tabella dei materiali. Preparare il…

Representative Results

L’assunzione intracellulare e la deplezione extracellulare di glucosio sono state misurate nei preadipociti 3T3-L1, in risposta a diverse concentrazioni di FD-glucosio (Figura 2) con e senza stimolazione insulinica. La Figura 2A mostra un aumento dose-dipendente dell’assorbimento intracellulare di FD-glucosio, che è stato significativamente aumentato in presenza di insulina. La concomitante diminuzione del fd-glucosio extracellulare nelle stesse cellule è most…

Discussion

Il confronto diretto della deplezione extracellulare di FD-glucosio con l’assorbimento di glucosio intracellulare normalizzato nella coltura cellulare ha mostrato un’alta correlazione, suggerendo che l’esaurimento extracellulare del glucosio potrebbe essere una misura surrogata per la valutazione dell’assorbimento del glucosio. La misurazione del glucosio FD extracellulare può utilizzare una vasta gamma di concentrazioni di glucosio FD, anche 0,5-2,5 μg FD-glucosio / mL sembrano fornire l’intervallo ottimale. Il glucos…

Materials

3T3-L1 mouse fibroblasts	ATCC	CL-173	Cell line
96-well plates	Falcon	353227	Plastic ware
B6.V-Lepob/J male mice	Jackson Laboratory	stock number 000632	Mice
BioTek Synergy H1 modular multimode microplate reader (Fisher Scientific, US)	Fisher Scientific, US	B-SHT	Device
Bovine serum	Gibco/ThermoFisher	161790-060	Cell culture
Calf serum	Gibco/ThermoFisher	26010-066	Cell culture
Cell incubator	Forma	Series II Water Jacket	Device
Diet (mouse/rat diet, irradiated)	Envigo	Teklad LM-485	Diet
Dimethylsulfoxide (DMSO)	Sigma LifeScience	D2650-100mL	Reagent
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Gibco/ThermoFisher	11965-092	Cell culture
Ethanol	Sigma Aldrich	E7023-500mL	Reagent
Fluorescent 2-deoxy-2-[(7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol-4-yl) amino]-D-glucose)	Sigma	72987-1MG	Assay
Glucose-free and phenol red-free DMEM	Gibco/ThermoFisher	A14430-01	Cell culture
Human insulin 10 mg/mL	MilliporeSigma, Cat N 91077C	Cat N 91077C	Reagent
Isoflurane, 5%	Henry Schein	NDC 11695-6776-2	Anestaetic
Penicillin/streptomycin (P/S)	Gibco/ThermoFisher	15140-122	Cell culture
Phosphate buffered solution	Sigma-Aldrich	DA537-500 mL	Cell culture
Pierce bicinchoninic acid (BCA) protein assay	ThermoFisher	Cat N23225	Assay
Radioimmunoprecipitation assay lysis buffer	Santa Cruz Biotechnology	sc-24948	Assay
Trypsin-EDTA (0.05%)	Gibco/ThermoFisher	25300-054	Cell culture