إنشاء عضويات الرئة البشرية والتمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة
Summary
يقدم البروتوكول طريقة لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من أنسجة الرئة الأولية ، وتوسيع عضويات الرئة وحث التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء 3D و 2D التي تنسخ بأمانة ظهارة مجرى الهواء البشري.
Abstract
عدم وجود نموذج قوي في المختبر للظهارة التنفسية البشرية يعيق فهم بيولوجيا وأمراض الجهاز التنفسي. نحن نصف بروتوكولا محددا لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من الخلايا الجذعية البالغة في أنسجة الرئة وتحفيز التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء الناضجة. ثم يتم توسيع العضوية الرئوية على التوالي لأكثر من 1 سنة مع استقرار عالي، في حين يتم استخدام العضوية مجرى الهواء المتمايزة لمحاكاة مورفولوجيا ووظيفيا ظهارة مجرى الهواء البشري إلى مستوى شبه فسيولوجي. وبالتالي ، فإننا نؤسس نموذجا عضويا قويا لظهارة مجرى الهواء البشري. إن التوسع طويل الأجل في عضويات الرئة وعضويات مجرى الهواء المتمايزة يولد مصدرا مستقرا ومتجددا ، مما يمكن العلماء من إعادة بناء وتوسيع الخلايا الظهارية لمجرى الهواء البشري في أطباق الاستزراع. يوفر نظام الرئة العضوية البشرية نموذجا فريدا ونشطا من الناحية الفسيولوجية في المختبر لمختلف التطبيقات ، بما في ذلك دراسة التفاعل بين الفيروس والمضيف ، واختبار الأدوية ، ونمذجة الأمراض.
Introduction
أصبحت المواد العضوية أداة قوية وعالمية لنمذجة تطور الأعضاء في المختبر ودراسة البيولوجيا والمرض. عند استزراعها في وسط استزراع محدد بعامل النمو ، يمكن توسيع الخلايا الجذعية البالغة (ASC) من مجموعة متنوعة من الأعضاء في 3 أبعاد (3D) وتجميعها ذاتيا في مجموعات خلوية تشبه الأعضاء تتكون من أنواع متعددة من الخلايا ، تسمى المواد العضوية. أبلغ مختبر كليفرز عن اشتقاق أول عضوي مشتق من ASC ، عضوي معوي بشري ، في عام 2009 1,2. بعد ذلك ، تم إنشاء عضويات مشتقة من ASC لمجموعة متنوعة من الأعضاء والأنسجة البشرية ، بما في ذلك البروستاتا3،4 ، والكبد5،6 ، والمعدة7،8،9 ، والبنكرياس 10 ، والغدة الثديية 11 ، والرئة 12،13 . احتفظت هذه المواد العضوية المشتقة من ASC بالخصائص الخلوية والهيكلية والوظيفية الحرجة للعضو الأصلي وحافظت على الاستقرار الجيني والمظهري في ثقافة التوسع طويلة الأجل14,15.
يمكن أيضا اشتقاق المواد العضوية من الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PSC) ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (ES) والخلية الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS)16. في حين أن المواد العضوية المشتقة من PSC تستغل آليات تطوير الأعضاء لإنشائها ، يمكن إجبار ASCs على تكوين عضويات عن طريق إعادة بناء الظروف التي تحاكي مكانة الخلايا الجذعية أثناء التجديد الذاتي للأنسجة الفسيولوجية أو إصلاح الأنسجة. تعد المواد العضوية المشتقة من PSC نماذج مواتية لاستكشاف التطور والتكوين العضوي ، وإن كانت غير قادرة على الوصول إلى مستوى النضج المماثل للعضويات المشتقة من ASC. حالة النضج الشبيهة بالجنين للعضويات المشتقة من PSC ، والتعقيد لإنشاء هذه المواد العضوية تمنع بشكل كبير تطبيقاتها الواسعة لدراسة البيولوجيا وعلم الأمراض في الأنسجة الناضجة.
تصطف القناة التنفسية البشرية ، من الأنف إلى القصيبات الطرفية ، مع ظهارة مجرى الهواء ، وتسمى أيضا الظهارة الهدبية الزائفة الطبقية ، والتي تتكون من أربعة أنواع رئيسية من الخلايا ، أي الخلايا الهدبية ، والخلية الكأسية ، والخلية القاعدية ، وخلية النادي. أنشأنا عضوي الرئة البشري المشتق من ASC من أنسجة الرئة البشرية بالتعاون مع مختبر Clevers12,13. يتم توسيع هذه المواد العضوية الرئوية على التوالي في وسط التوسع لأكثر من عام. تختلف المدة الدقيقة بين الخطوط العضوية المختلفة التي تم الحصول عليها من متبرعين مختلفين. ومع ذلك ، بالمقارنة مع ظهارة مجرى الهواء الأصلي ، فإن هذه المواد العضوية الرئوية القابلة للتوسيع على المدى الطويل ليست ناضجة بما فيه الكفاية لأن الخلايا الهدبية ، وهي مجموعة الخلايا الرئيسية في مجرى الهواء البشري ، ممثلة تمثيلا ناقصا في هذه المواد العضوية الرئوية. وهكذا ، قمنا بتطوير بروتوكول تمايز قريب وأنشأنا عضويات مجرى الهواء 3D و 2D التي تنسخ ظاهريا مورفولوجيا ووظيفيا ظهارة مجرى الهواء إلى مستوى شبه فسيولوجي.
هنا نقدم بروتوكول فيديو لاشتقاق عضويات الرئة البشرية من أنسجة الرئة الأولية ، وتوسيع عضويات الرئة وحث التمايز القريب لتوليد عضويات مجرى الهواء 3D و 2D.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصطف الشعب الهوائية البشرية مع ظهارة مجرى الهواء ، والمعروفة أيضا باسم الظهارة الهدبية الزائفة. أنواع الخلايا الرئيسية في ظهارة مجرى الهواء العلوي هي الخلايا الهدبية التي تمكن الحركة المنسقة لأهداب قمية لطرد المخاط والجسيمات المستنشقة من الشعب الهوائية ، والخلايا الكأسية التي تنتج وتف?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر مركز PanorOmic Sciences ووحدة المجهر الإلكتروني ، كلية لي كا شينغ للطب ، جامعة هونغ كونغ ، للمساعدة في التصوير البؤري وقياس التدفق الخلوي. وقد تم دعم هذا العمل جزئيا بتمويل من صندوق البحوث الصحية والطبية (HMRF و 17161272 و 19180392) التابع لمكتب الأغذية والصحة. الصندوق العام للبحوث (GRF، 17105420) التابع لمجلس المنح البحثية؛ Health@InnoHK، لجنة الابتكار والتكنولوجيا، حكومة منطقة هونغ كونغ الإدارية الخاصة.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
Riferimenti
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
- . Millicell ERS-2 User Guide Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 (2021)
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
