Établir des organoïdes pulmonaires humains et une différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires
Summary
Le protocole présente une méthode permettant de dériver des organoïdes pulmonaires humains à partir de tissus pulmonaires primaires, d’élargir les organoïdes pulmonaires et d’induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D qui phénopient fidèlement l’épithélium des voies respiratoires humaines.
Abstract
L’absence d’un modèle in vitro robuste de l’épithélium respiratoire humain entrave la compréhension de la biologie et de la pathologie du système respiratoire. Nous décrivons un protocole défini pour dériver des organoïdes pulmonaires humains à partir de cellules souches adultes dans le tissu pulmonaire et induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes matures des voies respiratoires. Les organoïdes pulmonaires sont ensuite étendus consécutivement pendant plus de 1 an avec une grande stabilité, tandis que les organoïdes différenciés des voies respiratoires sont utilisés pour simuler morphologiquement et fonctionnellement l’épithélium des voies respiratoires humaines à un niveau quasi physiologique. Ainsi, nous établissons un modèle organoïde robuste de l’épithélium des voies respiratoires humaines. L’expansion à long terme des organoïdes pulmonaires et des organoïdes différenciés des voies respiratoires génère une source stable et renouvelable, permettant aux scientifiques de reconstruire et d’étendre les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines dans les boîtes de culture. Le système organoïde pulmonaire humain fournit un modèle in vitro unique et physiologiquement actif pour diverses applications, y compris l’étude de l’interaction virus-hôte, le dépistage de médicaments et la modélisation de la maladie.
Introduction
Les organoïdes sont devenus un outil robuste et universel pour la modélisation in vitro du développement d’organes et l’étude de la biologie et de la maladie. Lorsqu’elles sont cultivées dans un milieu de culture défini par un facteur de croissance, les cellules souches adultes (ASC) d’une variété d’organes peuvent être étendues en 3 dimensions (3D) et auto-assemblées en grappes cellulaires semblables à des organes composées de plusieurs types de cellules, appelées organoïdes. Le laboratoire de Clevers a rapporté la dérivation du premier organoïde dérivé de l’ASC, l’organoïde intestinal humain, en 2009 1,2. Par la suite, des organoïdes dérivés de l’ASC ont été établis pour une variété d’organes et de tissus humains, y compris la prostate 3,4, le foie 5,6, l’estomac 7,8,9, le pancréas10, la glande mammaire11 et le poumon 12,13 . Ces organoïdes dérivés de l’ASC ont conservé les propriétés cellulaires, structurelles et fonctionnelles critiques de l’organe natif et ont maintenu la stabilité génétique et phénotypique dans la culture d’expansion à long terme14,15.
Les organoïdes peuvent également être dérivés de cellules souches pluripotentes (CSP), y compris les cellules souches embryonnaires (ES) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS)16. Alors que les organoïdes dérivés de PSC exploitent les mécanismes de développement des organes pour leur établissement, les ASC peuvent être contraints de former des organoïdes en reconstruisant des conditions qui imitent la niche des cellules souches lors de l’auto-renouvellement physiologique des tissus ou de la réparation des tissus. Les organoïdes dérivés de PSC sont des modèles favorables pour explorer le développement et l’organogenèse, bien qu’incapables d’atteindre le niveau de maturation comparable des organoïdes dérivés de l’ASC. L’état de maturation fœtale des organoïdes dérivés de la CSP et la complexité de l’établissement de ces organoïdes empêchent considérablement leurs vastes applications pour l’étude de la biologie et de la pathologie dans les tissus matures.
Les voies respiratoires humaines, du nez à la bronchiole terminale, sont tapissées de l’épithélium des voies respiratoires, également appelé épithélium cilié pseudostratifié, qui se compose de quatre principaux types de cellules, à savoir les cellules ciliées, les cellules gobelets, les cellules basales et les cellules club. Nous avons créé l’organoïde pulmonaire humain dérivé de l’ASC à partir de tissus pulmonaires humains en collaboration avec le laboratoire12,13 de Clevers. Ces organoïdes pulmonaires sont successivement dilatés dans le milieu d’expansion pendant plus d’un an; la durée précise varie selon les différentes lignées organoïdes obtenues auprès de différents donneurs. Cependant, par rapport à l’épithélium natif des voies respiratoires, ces organoïdes pulmonaires extensibles à long terme ne sont pas assez matures puisque les cellules ciliées, la principale population cellulaire des voies respiratoires humaines, sont sous-représentées dans ces organoïdes pulmonaires. Ainsi, nous avons développé un protocole de différenciation proximale et généré des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D qui phénocopisent morphologiquement et fonctionnellement l’épithélium des voies respiratoires à un niveau quasi physiologique.
Ici, nous fournissons un protocole vidéo pour dériver les organoïdes pulmonaires humains des tissus pulmonaires primaires, élargir les organoïdes pulmonaires et induire une différenciation proximale pour générer des organoïdes des voies respiratoires 3D et 2D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les voies respiratoires humaines sont tapissées de l’épithélium des voies respiratoires, également connu sous le nom d’épithélium cilié pseudostratifié. Les principaux types de cellules de l’épithélium des voies respiratoires supérieures sont les cellules ciliées qui permettent le mouvement coordonné de leurs cils apicals pour expulser le mucus et les particules inhalées des voies respiratoires, les cellules gobelet qui produisent et sécrètent du mucus et les cellules basales qui tapissent la membra…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le Centre des sciences panoromiques et de l’unité de microscope électronique, Faculté de médecine Li Ka Shing, Université de Hong Kong, pour son aide en imagerie confocale et en cytométrie en flux. Ce travail a été en partie soutenu par le financement du Fonds de recherche médicale et de santé (HMRF, 17161272 et 19180392) du Bureau de l’alimentation et de la santé; Fonds général de recherche (GRF, 17105420) du Conseil des subventions de recherche; et Health@InnoHK, Commission de l’innovation et de la technologie, le gouvernement de la Région administrative spéciale de Hong Kong.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
Riferimenti
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