Etablierung menschlicher Lungenorganoide und proximale Differenzierung zur Erzeugung reifer Atemwegsorganoide
Summary
Das Protokoll stellt eine Methode vor, um menschliche Lungenorganoide aus primärem Lungengewebe abzuleiten, die Lungenorganoide zu erweitern und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen, die das menschliche Atemwegsepithel originalgetreu phänokopieren.
Abstract
Das Fehlen eines robusten In-vitro-Modells des menschlichen respiratorischen Epithels behindert das Verständnis der Biologie und Pathologie des Atmungssystems. Wir beschreiben ein definiertes Protokoll, um menschliche Lungenorganoide aus adulten Stammzellen im Lungengewebe abzuleiten und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um reife Atemwegsorganoide zu erzeugen. Die Lungenorganoide werden dann nacheinander für über 1 Jahr mit hoher Stabilität expandiert, während die differenzierten Atemwegsorganoide verwendet werden, um das menschliche Atemwegsepithel morphologisch und funktionell auf ein nahezu physiologisches Niveau zu simulieren. Damit etablieren wir ein robustes Organoidmodell des menschlichen Atemwegsepithels. Die langfristige Expansion von Lungenorganoiden und differenzierten Atemwegsorganoiden erzeugt eine stabile und erneuerbare Quelle, die es Wissenschaftlern ermöglicht, die menschlichen Atemwegsepithelzellen in Kulturschalen zu rekonstruieren und zu erweitern. Das Organoidsystem der menschlichen Lunge bietet ein einzigartiges und physiologisch aktives In-vitro-Modell für verschiedene Anwendungen, einschließlich der Untersuchung der Virus-Wirt-Interaktion, der Arzneimitteltests und der Krankheitsmodellierung.
Introduction
Organoide sind zu einem robusten und universellen Werkzeug für die In-vitro-Modellierung der Organentwicklung und das Studium von Biologie und Krankheit geworden. Bei der Kultivierung in einem wachstumsfaktordefinierten Kulturmedium können adulte Stammzellen (ASC) aus einer Vielzahl von Organen in 3-dimensionalen (3D) erweitert und selbst zu organähnlichen Zellclustern zusammengesetzt werden, die aus mehreren Zelltypen, sogenannten Organoiden, bestehen. Das Labor von Clevers berichtete 2009 über die Ableitung des ersten von ASC abgeleiteten Organoids, des menschlichen Darmorganoids, 1,2. Danach wurden ASC-abgeleitete Organoide für eine Vielzahl von menschlichen Organen und Geweben etabliert, darunter Prostata 3,4, Leber5,6, Magen 7,8,9, Bauchspeicheldrüse 10, Brustdrüse 11 und Lunge 12,13 . Diese ASC-abgeleiteten Organoide behielten die kritischen zellulären, strukturellen und funktionellen Eigenschaften des nativen Organs bei und bewahrten die genetische und phänotypische Stabilität in der Langzeitexpansionskultur14,15.
Organoide können auch aus pluripotenten Stammzellen (PSC) gewonnen werden, einschließlich embryonaler Stammzellen (ES) und induzierter pluripotenter Stammzellen (iPS)16. Während PSC-abgeleitete Organoide die Mechanismen der Organentwicklung für ihre Etablierung ausnutzen, können ASCs gezwungen werden, Organoide zu bilden, indem Bedingungen wieder aufgebaut werden, die die Stammzellnische während der physiologischen Gewebeselbsterneuerung oder Gewebereparatur nachahmen. PSC-abgeleitete Organoide sind günstige Modelle, um die Entwicklung und Organogenese zu erforschen, obwohl sie nicht in der Lage sind, den vergleichbaren Reifegrad von ASC-abgeleiteten Organoiden zu erreichen. Der fetale Reifungsstatus von PSC-abgeleiteten Organoiden und die Komplexität bei der Etablierung dieser Organoide verhindern im Wesentlichen ihre breiten Anwendungen für das Studium der Biologie und Pathologie in reifen Geweben.
Die menschlichen Atemwege, von der Nase bis zur terminalen Bronchiole, sind mit dem Atemwegsepithel ausgekleidet, auch pseudostratifiziertes Flimmerepithel genannt, das aus vier Hauptzelltypen besteht, d.h. Flimmerzelle, Kelchzelle, Basalzelle und Keulenzelle. Wir haben das von ASC abgeleitete humane Lungenorganoid aus menschlichem Lungengewebe in Zusammenarbeit mit dem Labor12,13 von Clevers etabliert. Diese Lungenorganoide werden im Expansionsmedium über ein Jahr lang nacheinander expandiert; Die genaue Dauer variiert zwischen verschiedenen Organoidlinien, die von verschiedenen Spendern erhalten wurden. Im Vergleich zum nativen Atemwegsepithel sind diese langfristig expandierbaren Lungenorganoide jedoch nicht reif genug, da Flimmerzellen, die Hauptzellpopulation in den menschlichen Atemwegen, in diesen Lungenorganoiden unterrepräsentiert sind. Daher entwickelten wir ein proximales Differenzierungsprotokoll und erzeugten 3D- und 2D-Atemwegsorganoide, die das Atemwegsepithel morphologisch und funktionell auf ein nahezu physiologisches Niveau phänokopieren.
Hier stellen wir ein Videoprotokoll zur Verfügung, um menschliche Lungenorganoide aus dem primären Lungengewebe abzuleiten, die Lungenorganoide zu erweitern und eine proximale Differenzierung zu induzieren, um 3D- und 2D-Atemwegsorganoide zu erzeugen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die menschlichen Atemwege sind mit dem Atemwegsepithel ausgekleidet, das auch als pseudostratifiziertes Flimmerepithel bekannt ist. Die Hauptzelltypen des Epithels der oberen Atemwege sind Flimmerzellen, die die koordinierte Bewegung ihrer apikalen Zilien ermöglichen, um Schleim und eingeatmete Partikel aus den Atemwegen auszustoßen, Becherzellen, die Schleim produzieren und absondern, und Basalzellen, die die Basalmembran auskleiden und an der Regeneration beteiligt sind. In den kleinen Atemwegen wie den Bronchiolen e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken dem Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, für die Unterstützung bei der konfokalen Bildgebung und Durchflusszytometrie. Diese Arbeit wurde teilweise durch Mittel aus dem Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 and 19180392) des Food and Health Bureau unterstützt; General Research Fund (GRF, 17105420) des Research Grants Council; und Health@InnoHK, Innovation and Technology Commission, die Regierung der Sonderverwaltungszone Hongkong.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
Riferimenti
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
- . Millicell ERS-2 User Guide Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 (2021)
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
