Stabilire organoidi polmonari umani e differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree
Summary
Il protocollo presenta un metodo per derivare organoidi polmonari umani da tessuti polmonari primari, espandere gli organoidi polmonari e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree 3D e 2D che fenocopio fedelmente l’epitelio delle vie aeree umane.
Abstract
La mancanza di un robusto modello in vitro dell’epitelio respiratorio umano ostacola la comprensione della biologia e della patologia dell’apparato respiratorio. Descriviamo un protocollo definito per derivare organoidi polmonari umani da cellule staminali adulte nel tessuto polmonare e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi maturi delle vie aeree. Gli organoidi polmonari vengono poi espansi consecutivamente per oltre 1 anno con elevata stabilità, mentre gli organoidi differenziati delle vie aeree vengono utilizzati per simulare morfologicamente e funzionalmente l’epitelio delle vie aeree umane a un livello quasi fisiologico. Pertanto, stabiliamo un robusto modello organoide dell’epitelio delle vie aeree umane. L’espansione a lungo termine degli organoidi polmonari e degli organoidi differenziati delle vie aeree genera una fonte stabile e rinnovabile, consentendo agli scienziati di ricostruire ed espandere le cellule epiteliali delle vie aeree umane nei piatti di coltura. Il sistema organoide polmonare umano fornisce un modello in vitro unico e fisiologicamente attivo per varie applicazioni, tra cui lo studio dell’interazione virus-ospite, test antidroga e modellazione della malattia.
Introduction
Gli organoidi sono diventati uno strumento robusto e universale per la modellazione in vitro dello sviluppo degli organi e lo studio della biologia e delle malattie. Quando coltivate in un terreno di coltura definito dal fattore di crescita, le cellule staminali adulte (ASC) da una varietà di organi possono essere espanse in 3 dimensioni (3D) e auto-assemblate in cluster cellulari simili a organi composti da più tipi di cellule, denominati organoidi. Il laboratorio di Clevers ha riportato la derivazione del primo organoide derivato dall’ASC, organoide intestinale umano, nel 2009 1,2. Successivamente, gli organoidi derivati dall’ASC sono stati stabiliti per una varietà di organi e tessuti umani, tra cui prostata 3,4, fegato 5,6, stomaco 7,8,9, pancreas10, ghiandola mammaria11 e polmone 12,13 . Questi organoidi derivati dall’ASC hanno mantenuto le proprietà cellulari, strutturali e funzionali critiche dell’organo nativo e hanno mantenuto la stabilità genetica e fenotipica nella coltura di espansione a lungo termine14,15.
Gli organoidi possono anche essere derivati da cellule staminali pluripotenti (PSC), comprese le cellule staminali embrionali (ES) e le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS)16. Mentre gli organoidi derivati dal PSC sfruttano i meccanismi di sviluppo degli organi per la loro istituzione, gli ASC possono essere costretti a formare organoidi ricostruendo condizioni che imitano la nicchia delle cellule staminali durante l’auto-rinnovamento fisiologico dei tessuti o la riparazione dei tessuti. Gli organoidi derivati da PSC sono modelli favorevoli per esplorare lo sviluppo e l’organogenesi, sebbene incapaci di raggiungere il livello di maturazione comparabile degli organoidi derivati da ASC. Lo stato di maturazione simile a quello fetale degli organoidi derivati dal PSC e la complessità per stabilire questi organoidi impediscono sostanzialmente le loro ampie applicazioni per lo studio della biologia e della patologia nei tessuti maturi.
Il tratto respiratorio umano, dal naso al bronchiolo terminale, è rivestito con l’epitelio delle vie aeree, chiamato anche epitelio ciliato pseudostratificato, che consiste di quattro tipi di cellule principali, cioè cellule ciliate, cellule calici, cellule basali e cellule club. Abbiamo stabilito l’organoide polmonare umano derivato dall’ASC da tessuti polmonari umani in collaborazione con il laboratorio 12,13 di Clevers. Questi organoidi polmonari vengono espansi consecutivamente nel mezzo di espansione per oltre un anno; la durata precisa varia tra diverse linee organoidi ottenute da diversi donatori. Tuttavia, rispetto all’epitelio nativo delle vie aeree, questi organoidi polmonari espandibili a lungo termine non sono abbastanza maturi poiché le cellule ciliate, la principale popolazione cellulare nelle vie aeree umane, sono sottorappresentate in questi organoidi polmonari. Pertanto, abbiamo sviluppato un protocollo di differenziazione prossimale e generato organoidi delle vie aeree 3D e 2D che morfologicamente e funzionalmente fenocopio l’epitelio delle vie aeree a un livello quasi fisiologico.
Qui forniamo un protocollo video per derivare organoidi polmonari umani dai tessuti polmonari primari, espandere gli organoidi polmonari e indurre la differenziazione prossimale per generare organoidi delle vie aeree 3D e 2D.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le vie aeree umane sono rivestite con l’epitelio delle vie aeree, noto anche come epitelio ciliato pseudostratificato. I principali tipi di cellule dell’epitelio delle vie aeree superiori sono le cellule ciliate che consentono il movimento coordinato delle loro ciglia apicali per espellere il muco e le particelle inalate dalle vie aeree, le cellule calici che producono e secernono muco e le cellule basali che rivestono la membrana basale e sono implicate nella rigenerazione. Nelle piccole vie aeree come i bronchioli, l’e…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Faculty of Medicine, University of Hong Kong, per l’assistenza nell’imaging confocale e nella citometria a flusso. Questo lavoro è stato in parte sostenuto dai finanziamenti del Fondo per la salute e la ricerca medica (HMRF, 17161272 e 19180392) dell’Ufficio per la salute e la salute; Fondo generale di ricerca (GRF, 17105420) del Consiglio per le sovvenzioni alla ricerca; e Health@InnoHK Commissione per l’innovazione e la tecnologia, il governo della Regione amministrativa speciale di Hong Kong.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
Riferimenti
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
- . Millicell ERS-2 User Guide Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 (2021)
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
