Estabelecendo organoides pulmonares humanos e diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas
Summary
O protocolo apresenta um método para derivar organoides pulmonares humanos de tecidos pulmonares primários, expandir os organoides pulmonares e induzir diferenciação proximal para gerar organoides das vias aéreas 3D e 2D que ferem fielmente o epitélio das vias aéreas humanas.
Abstract
A falta de um modelo in vitro robusto do epitélio respiratório humano dificulta a compreensão da biologia e patologia do sistema respiratório. Descrevemos um protocolo definido para derivar organoides pulmonares humanos de células-tronco adultas no tecido pulmonar e induzir diferenciação proximal para gerar organoides maduros das vias aéreas. Os organoides pulmonares são então expandidos consecutivamente por mais de 1 ano com alta estabilidade, enquanto os organoides diferenciados das vias aéreas são usados para simular morfológica e funcionalmente o epitélio das vias aéreas humanas a um nível quase fisiológico. Assim, estabelecemos um modelo organoide robusto do epitélio das vias aéreas humanas. A expansão a longo prazo de organoides pulmonares e organoides diferenciados das vias aéreas gera uma fonte estável e renovável, permitindo aos cientistas reconstruir e expandir as células epiteliais das vias aéreas humanas em pratos culturais. O sistema organoide pulmonar humano fornece um modelo in vitro único e fisiologicamente ativo para várias aplicações, incluindo o estudo da interação entre vírus e hospedeiros, testes medicamentosos e modelagem de doenças.
Introduction
Os organoides tornaram-se uma ferramenta robusta e universal para a modelagem in vitro do desenvolvimento de órgãos e estudo da biologia e da doença. Quando cultivadas em um meio de cultura definido por fatores de crescimento, as células-tronco adultas (ASC) de uma variedade de órgãos podem ser expandidas em 3 dimensões (3D) e auto-montadas em aglomerados celulares semelhantes a órgãos compostos por múltiplos tipos de células, denominados organoides. O laboratório de Clevers relatou a derivação do primeiro organoide derivado do ASC, organoide intestinal humano, em 2009 1,2. Posteriormente, organoides derivados do ASC foram estabelecidos para uma variedade de órgãos e tecidos humanos, incluindo próstata 3,4, fígado 5,6, estômago 7,8,9, pâncreas10, glândula mamária11 e pulmão 12,13 . Esses organoides derivados do ASC mantiveram as propriedades críticas celulares, estruturais e funcionais do órgão nativo e mantiveram a estabilidade genética e fenotípica na cultura de expansão de longo prazo14,15.
Organoides também podem ser derivados de células-tronco pluripotentes (PSC), incluindo células de tronco embrionária (ES) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPS)16. Enquanto organoides derivados do PSC exploram os mecanismos de desenvolvimento de órgãos para seu estabelecimento, as ASCs podem ser coagidas a formar organoides por meio da reconstrução de condições que imitam o nicho de células-tronco durante a autoconexão do tecido fisiológico ou reparação de tecidos. Os organoides derivados do PSC são modelos favoráveis para explorar o desenvolvimento e a organogênese, embora incapazes de atingir o nível de maturação comparável dos organoides derivados do ASC. O estado de maturação fetal dos organoides derivados do PSC e a complexidade para o estabelecimento desses organoides impedem substancialmente suas amplas aplicações para estudar biologia e patologia em tecidos maduros.
O trato respiratório humano, do nariz ao brônquio terminal, é forrado com o epitélio das vias aéreas, também chamado de epitélio ciliado pseudostratificado, que consiste em quatro tipos principais de células, ou seja, célula ciliada, célula de cálice, célula basal e célula do clube. Estabelecemos o organoide pulmonar humano derivado do ASC a partir de tecidos pulmonares humanos em colaboração com o laboratório 12,13 da Clevers. Esses organoides pulmonares são consecutivamente expandidos no meio de expansão por mais de um ano; a duração precisa varia entre diferentes linhas organoides obtidas de diferentes doadores. No entanto, em comparação com o epitélio das vias aéreas nativas, esses organoides pulmonares expansíveis de longo prazo não são maduros o suficiente, uma vez que as células ciliadas, a maior população celular nas vias aéreas humanas, são sub-representadas nesses organoides pulmonares. Assim, desenvolvemos um protocolo de diferenciação proximal e geramos organoides das vias aéreas 3D e 2D que, morfologicamente e funcionalmente, fenóquico das vias aéreas, a um nível quase fisiológico.
Aqui fornecemos um protocolo de vídeo para derivar organoides pulmonares humanos dos tecidos pulmonares primários, expandir os organoides pulmonares e induzir diferenciação proximal para gerar organoides 3D e 2D das vias aéreas.
Protocol
Representative Results
Discussion
As vias aéreas humanas são forradas com o epitélio das vias aéreas, também conhecido como epitélio ciliado pseudostratificado. Os principais tipos celulares do epitélio das vias aéreas superiores são células ciliadas que permitem o movimento coordenado de seus cílios apical para expelir muco e partículas inaladas das vias aéreas, células de cálice que produzem e secretam muco, e células basais que revestem a membrana do porão e estão implicadas na regeneração. Nas pequenas vias aéreas, como os brônq…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos ao Centro de Ciências Panorômicas e Unidade de Microscópio Eletrônico, Li Ka Shing Faculty of Medicine, Universidade de Hong Kong, pela assistência em imagens confocal e citometria de fluxo. Este trabalho foi parcialmente apoiado pelo financiamento do Fundo de Pesquisa Médica e de Saúde (HMRF, 17161272 e 19180392) da Secretaria de Alimentação e Saúde; Fundo Geral de Pesquisa (GRF, 17105420) do Conselho de Bolsas de Pesquisa; e Health@InnoHK, Comissão de Inovação e Tecnologia, o Governo da Região Administrativa Especial de Hong Kong.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
Riferimenti
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