Summary

Создание органоидов легких человека и проксимальной дифференцировки для генерации зрелых органоидов дыхательных путей

Published: March 23, 2022
doi:

Summary

В протоколе представлен метод получения органоидов легких человека из первичных легочных тканей, расширения органоидов легких и индуцирования проксимальной дифференцировки для генерации 3D и 2D органоидов дыхательных путей, которые точно фенокопируют эпителий дыхательных путей человека.

Abstract

Отсутствие надежной in vitro модели респираторного эпителия человека препятствует пониманию биологии и патологии дыхательной системы. Мы описываем определенный протокол для получения органоидов легких человека из взрослых стволовых клеток в легочной ткани и индуцирования проксимальной дифференцировки для генерации зрелых органоидов дыхательных путей. Затем органоиды легких последовательно расширяются в течение более 1 года с высокой стабильностью, в то время как дифференцированные органоиды дыхательных путей используются для морфологического и функционального моделирования эпителия дыхательных путей человека до почти физиологического уровня. Таким образом, мы устанавливаем надежную органоидную модель эпителия дыхательных путей человека. Долгосрочное расширение легочных органоидов и дифференцированных органоидов дыхательных путей создает стабильный и возобновляемый источник, позволяющий ученым реконструировать и расширять эпителиальные клетки дыхательных путей человека в культуральных чашках. Органоидная система легких человека обеспечивает уникальную и физиологически активную модель in vitro для различных применений, включая изучение взаимодействия вируса и хозяина, тестирование лекарств и моделирование заболеваний.

Introduction

Органоиды стали надежным и универсальным инструментом для моделирования in vitro развития органов и изучения биологии и болезней. При культивировании в культуральной среде, определяемой фактором роста, взрослые стволовые клетки (ASC) из различных органов могут быть расширены в 3-мерном (3D) и самособраны в органоподобные клеточные кластеры, состоящие из нескольких типов клеток, называемых органоидами. Лаборатория Клеверса сообщила о происхождении первого органоида, полученного из САС, органоида кишечника человека, в 2009 году 1,2. После этого были установлены органоиды, полученные из САС, для различных органов и тканей человека, включая простату 3,4, печень 5,6, желудок 7,8,9, поджелудочную железу10, молочную железу11 и легкие 12,13 . Эти органоиды, полученные из ASC, сохраняли критические клеточные, структурные и функциональные свойства нативного органа и поддерживали генетическую и фенотипическую стабильность в культуре долгосрочного расширения14,15.

Органоиды также могут быть получены из плюрипотентных стволовых клеток (PSC), включая эмбриональные стволовые (ES) клетки и индуцированную плюрипотентную стволовую (iPS) клетку16. В то время как органоиды, полученные из PSC, используют механизмы развития органов для своего создания, ИСС могут быть принуждены к образованию органоидов путем восстановления условий, которые имитируют нишу стволовых клеток во время физиологического самообновления тканей или восстановления тканей. Органоиды, полученные из PSC, являются благоприятными моделями для изучения развития и органогенеза, хотя и не могут достичь сопоставимого уровня созревания органоидов, полученных из ASC. Фетально-подобный статус созревания органоидов, полученных из PSC, и сложность создания этих органоидов существенно препятствуют их широкому применению для изучения биологии и патологии в зрелых тканях.

Дыхательные пути человека, от носа до терминальных бронхиол, выстланы эпителием дыхательных путей, также называемым псевдостратифицированным реснитчатым эпителием, который состоит из четырех основных типов клеток, то есть реснитчатых клеток, бокаловидных клеток, базальных клеток и клубных клеток. Мы установили органоид легких человека, полученный из ASC, из легочных тканей человека в сотрудничестве с лабораторией Clevers12,13. Эти леговидные органоиды последовательно расширяются в расширительной среде в течение более года; точная продолжительность варьируется между различными органоидными линиями, полученными от разных доноров. Однако, по сравнению с нативным эпителием дыхательных путей, эти долгосрочные расширяемые органоиды легких недостаточно зрелы, поскольку реснитчатые клетки, основная клеточная популяция в дыхательных путях человека, недостаточно представлены в этих легких органоидах. Таким образом, мы разработали протокол проксимальной дифференцировки и сгенерировали 3D и 2D органоиды дыхательных путей, которые морфологически и функционально фенокопируют эпителий дыхательных путей до почти физиологического уровня.

Здесь мы предоставляем видеопротокол для получения органоидов легких человека из первичных легочных тканей, расширения органоидов легких и индуцирования проксимальной дифференцировки для генерации 3D и 2D органоидов дыхательных путей.

Protocol

Все эксперименты с использованием тканей человека, описанные в настоящем документе, были одобрены Институциональным наблюдательным советом Университета Гонконга / Управлением больниц Гонконга Западного кластера (UW13-364 и UW21-695). Информированное согласие было получено от пациентов до с?…

Representative Results

Этот протокол позволяет получать органоиды легких человека с высоким уровнем успеха. Свежая легочная ткань человека измельчается на мелкие кусочки, а затем разлагается коллагеназой. Полученные одиночные клетки внедряются в фундаментную матрицу и инкубируются в среде расширения орга…

Discussion

Дыхательные пути человека выстланы эпителием дыхательных путей, также известным как псевдостратифицированный реснитчатый эпителий. Основными типами клеток эпителия верхних дыхательных путей являются реснитчатые клетки, которые обеспечивают скоординированное движение их апикальн?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Центр Панорамных Наук и Подразделение Электронного Микроскопа, Медицинский факультет Ли Ка Шинг Университета Гонконга, за помощь в конфокальной визуализации и проточной цитометрии. Эта работа была частично поддержана финансированием из Фонда медицинских исследований в области здравоохранения (HMRF, 17161272 и 19180392) Бюро продовольствия и здравоохранения; Общий исследовательский фонд (GRF, 17105420) Совета по исследовательским грантам; и Health@InnoHK, Комиссия по инновациям и технологиям, правительство Специального административного района Гонконг.

Materials

Reagents for lung organoid culture
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634010
A8301 Tocris 2939 500nM
B27 supplement Invitrogen 17504-044 1x
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) Trevigen 3533-010-0 70-80%
FGF-10 Peprotech 100-26 20 ng/mL
FGF-7 Peprotech 100-19 5 ng/mL
GlutaMAX (glutamine) Invitrogen 35050061 1x
HEPES 1M Invitrogen 15630-056 10 mM
Heregulin β-1 Peprotech 100-03 5 nM
N-Acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165 1.25 mM
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636 10 mM
Noggin (conditional medium) home made 10x
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Invitrogen 15140-122 1x
Primocin Invivogen ant-pm-1 100 µg/mL
Rspondin1 (conditional medium) home made 10x
SB202190 Sigma-Aldrich S7067 1 µM
Y-27632 Tocris 1254 5 µM
Proximal differentiation medium
DAPT Tocris 2634 10 µM
Heparin Solution StemCell Technology 7980 4 µg/mL
Hydrocortisone Stock Solution StemCell Technology 7925 1 µM
PneumaCult-ALI 10X Supplement air liquid interface supplement
PneumaCult-ALI Basal Medium StemCell Technology 05001 air liquid interface basal medium
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement air liquid interface maintenance supplement
Y-27632 Tocris 1254 10 µM
Equipment
Biological safety cabinet Baker 1-800-992-2537
Carl Zeiss LSM 780 or 800 Zeiss confocal microscope
CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 42093483
Stereo-microscope Olympus Corporation CKX31SF
Centrifuge Eppendorf 5418BG040397
Serological pipettor Eppendorf
Micropipette Eppendorf
ZEN black or ZEN blue software Zeiss analysis software
Consumables
12mm Trans-well StemCell Technology #38023
12-well cell culture plate Cellstar 665970
15- and 50 ml conical tubes Thermo Fisher Scientific L6BF5Z8118
24-well cell culture plate Cellstar 662160
6.5mm Trans-well StemCell Technology #38024
Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm Sigma-Aldrich SLGPR33RB
Microfuge tubes Eppendorf
Micropipette tips Thermo Fisher Scientific TFLR140-200-Q21190531
Pasteur pipette glass Thermo Fisher Scientific 22-378893
Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) Thermo Fisher Scientific BA08003, 08004, 08005
Antibodies
Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 Invitrogen A11005
Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 Invitrogen A11001
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 Invitrogen A11034
Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 Invitrogen A11037
Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 Invitrogen A11007
Mouse Anti-Cytokeratin 5 Abcam ab128190
Mouse Anti-FOX J1 Invitrogen 14-9965-82
Mouse Anti-Mucin 5AC Abcam ab3649
Mouse Anti-β-tubulin 4 Sigma T7941
Rabbit Anti-p63 Abcam ab124762
Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 R&D Systems MAB4218-SP
Other reagent
TrypLE Select Enzyme (10X) Thermo Fisher Scientific A1217701 dissociation enzyme

Riferimenti

  1. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  2. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  3. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  4. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
  5. Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
  6. Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
  7. Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
  8. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
  9. Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
  10. Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
  11. Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
  12. Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
  13. Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
  14. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  15. Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
  16. Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
  17. . Millicell ERS-2 User Guide Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 (2021)
  18. Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
  19. Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
  20. Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
  21. Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
  22. Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
  23. Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
  24. Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
  25. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
  26. Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
  27. Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
  28. Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
  29. Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
  30. Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
  31. Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
  32. Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
  33. Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
  34. Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
check_url/it/63684?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Li, C., Chiu, M. C., Yu, Y., Liu, X., Xiao, D., Huang, J., Wan, Z., Zhou, J. Establishing Human Lung Organoids and Proximal Differentiation to Generate Mature Airway Organoids. J. Vis. Exp. (181), e63684, doi:10.3791/63684 (2022).

View Video