Olgun Hava Yolu Organoidleri Üretmek için İnsan Akciğer Organoidlerinin ve Proksimal Farklılaşmasının Kurulması
Summary
Protokol, insan akciğer organoidlerini birincil akciğer dokularından türetmek, akciğer organoidlerini genişletmek ve insan hava yolu epitelini sadık bir şekilde fenotoskopik eden 3D ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşmayı indüklemek için bir yöntem sunar.
Abstract
İnsan solunum epitelinin sağlam bir in vitro modelinin olmaması, solunum sisteminin biyolojisinin ve patolojisinin anlaşılmasını engellemektedir. İnsan akciğer organoidlerini akciğer dokusundaki yetişkin kök hücrelerden türetmek ve olgun hava yolu organoidleri oluşturmak için proksimal farklılaşmayı indüklemek için tanımlanmış bir protokol tanımladık. Akciğer organoidleri daha sonra yüksek stabilite ile 1 yıldan fazla bir süre boyunca ardışık olarak genişletilirken, farklılaşmış hava yolu organoidleri morfolojik ve fonksiyonel olarak insan hava yolu epitelini fizyolojik bir seviyeye yakın bir seviyeye kadar simüle etmek için kullanılır. Böylece, insan hava yolu epitelinin sağlam bir organoid modelini oluşturuyoruz. Akciğer organoidlerinin ve farklılaşmış hava yolu organoidlerinin uzun süreli genişlemesi, bilim adamlarının kültür yemeklerinde insan hava yolu epitel hücrelerini yeniden yapılandırmalarını ve genişletmelerini sağlayan istikrarlı ve yenilenebilir bir kaynak oluşturur. İnsan akciğer organoid sistemi, virüs-konakçı etkileşimi, ilaç testi ve hastalık modellemesinin incelenmesi de dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için benzersiz ve fizyolojik olarak aktif bir in vitro model sağlar.
Introduction
Organoidler, organ gelişiminin in vitro modellenmesi ve biyoloji ve hastalıkların incelenmesi için sağlam ve evrensel bir araç haline gelmiştir. Büyüme faktörü tanımlı bir kültür ortamında kültürlendiğinde, çeşitli organlardan gelen yetişkin kök hücreler (ASC) 3 boyutlu (3B) olarak genişletilebilir ve organoidler olarak adlandırılan çoklu hücre tiplerinden oluşan organ benzeri hücresel kümelere kendiliğinden monte edilebilir. Clevers’in laboratuvarı, 2009 yılında ilk ASC türevi organoid, insan bağırsak organoidinin türetildiğini bildirdi 1,2. Daha sonra, prostat 3,4, karaciğer 5,6, mide 7,8,9, pankreas 10, meme bezi 11 ve akciğer 12,13 dahil olmak üzere çeşitli insan organları ve dokuları için ASC türevi organoidler kurulmuştur. . Bu ASC türevi organoidler, doğal organın kritik hücresel, yapısal ve fonksiyonel özelliklerini korumuş ve uzun süreli genişleme kültüründe genetik ve fenotipik stabiliteyi korumuştur14,15.
Organoidler ayrıca embriyonik kök (ES) hücreler ve indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücre16 dahil olmak üzere pluripotent kök hücreden (PSC) türetilebilir. PSC türevi organoidler, kuruluşları için organ gelişim mekanizmalarından yararlanırken, ASC’ler, fizyolojik doku kendini yenileme veya doku onarımı sırasında kök hücre nişini taklit eden koşulları yeniden inşa ederek organoidler oluşturmaya zorlanabilir. PSC türevi organoidler, ASC türevi organoidlerin karşılaştırılabilir olgunlaşma seviyesine ulaşamasalar da, gelişim ve organogenezi araştırmak için elverişli modellerdir. PSC türevi organoidlerin fetal benzeri olgunlaşma durumu ve bu organoidlerin kurulmasının karmaşıklığı, olgun dokularda biyoloji ve patolojiyi incelemek için geniş uygulamalarını büyük ölçüde engellemektedir.
Burundan terminal bronşiyolele kadar insan solunum yolu, dört ana hücre tipinden, yani siliye hücre, kadeh hücresi, bazal hücre ve kulüp hücresinden oluşan psödostratifiye siliyer epitel olarak da adlandırılan hava yolu epiteli ile kaplıdır. ASC türevi insan akciğer organoidini, Clevers’in laboratuvarı12,13 ile işbirliği içinde insan akciğer dokularından kurduk. Bu akciğer organoidleri, bir yıldan fazla bir süredir genişleme ortamında ardışık olarak genişletilir; kesin süre, farklı donörlerden elde edilen farklı organoid çizgiler arasında değişir. Bununla birlikte, doğal hava yolu epiteli ile karşılaştırıldığında, bu uzun süreli genişleyen akciğer organoidleri, insan hava yolundaki ana hücre popülasyonu olan siliyer hücreler bu akciğer organoidlerinde yeterince temsil edilmediğinden, yeterince olgun değildir. Bu nedenle, proksimal bir farklılaşma protokolü geliştirdik ve hava yolu epitelini morfolojik ve fonksiyonel olarak fizyolojik bir seviyeye yakın bir seviyeye kopyalayan 3D ve 2D hava yolu organoidleri ürettik.
Burada, birincil akciğer dokularından insan akciğer organoidlerini türetmek, akciğer organoidlerini genişletmek ve 3D ve 2D hava yolu organoidleri üretmek için proksimal farklılaşmayı indüklemek için bir video protokolü sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan hava yolları, psödostratifiye siliyer epitel olarak da bilinen hava yolu epiteli ile kaplıdır. Üst solunum yolu epitelinin ana hücre tipleri, apikal kirpiklerinin mukus ve solunan parçacıkları hava yollarından dışarı atmak için koordineli hareketini sağlayan siliye hücreler, mukus üreten ve salgılayan kadeh hücreleri ve bazal membranı kaplayan ve rejenerasyonda rol oynayan bazal hücrelerdir. Bronşiyoller gibi küçük hava yolunda, küboidal hava yolu epiteli, salgı kulübü hücreleri ve ü…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hong Kong Üniversitesi PanorOmik Bilimler ve Elektron Mikroskobu Birimi Merkezi, Li Ka Shing Tıp Fakültesi’ne konfokal görüntüleme ve akış sitometrisindeki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma kısmen Gıda ve Sağlık Bürosu’nun Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu’ndan (HMRF, 17161272 ve 19180392) gelen fonlarla desteklenmiştir; Araştırma Hibeleri Konseyi Genel Araştırma Fonu (GRF, 17105420); ve Health@InnoHK, İnovasyon ve Teknoloji Komisyonu, Hong Kong Özel İdari Bölgesi Hükümeti.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
Riferimenti
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
- . Millicell ERS-2 User Guide Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 (2021)
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
