Etablering av mänskliga lungorganoider och proximal differentiering för att generera mogna luftvägsorganoider
Summary
Protokollet presenterar en metod för att härleda mänskliga lungorganoider från primära lungvävnader, expandera lungorganoiderna och inducera proximal differentiering för att generera 3D- och 2D-luftvägsorganoider som troget fenoskopierar det mänskliga luftvägsepitelet.
Abstract
Bristen på en robust in vitro-modell av det mänskliga andningsepitelet hindrar förståelsen av andningsorganens biologi och patologi. Vi beskriver ett definierat protokoll för att härleda humana lungorganoider från vuxna stamceller i lungvävnaden och inducera proximal differentiering för att generera mogna luftvägsorganoider. Lungorganoiderna expanderas sedan i följd i över 1 år med hög stabilitet, medan de differentierade luftvägsorganoiderna används för att morfologiskt och funktionellt simulera humant luftvägsepitel till en nästan fysiologisk nivå. Således etablerar vi en robust organoidmodell av det mänskliga luftvägsepitelet. Den långsiktiga expansionen av lungorganoider och differentierade luftvägsorganoider genererar en stabil och förnybar källa, vilket gör det möjligt för forskare att rekonstruera och expandera de mänskliga luftvägsepitelcellerna i odlingsrätter. Det mänskliga lungorganoidsystemet ger en unik och fysiologiskt aktiv in vitro-modell för olika applikationer, inklusive studier av virus-värdinteraktion, läkemedelstestning och sjukdomsmodellering.
Introduction
Organoider har blivit ett robust och universellt verktyg för in vitro-modellering av organutveckling och studier av biologi och sjukdom. När de odlas i ett tillväxtfaktordefinierat odlingsmedium kan vuxna stamceller (ASC) från en mängd olika organ expanderas i 3-dimension (3D) och självmonteras till organliknande cellulära kluster som består av flera celltyper, så kallade organoider. Clevers laboratorium rapporterade härledningen av den första ASC-härledda organoiden, human tarmorganoid, 2009 1,2. Efteråt har ASC-härledda organoider etablerats för en mängd olika mänskliga organ och vävnader, inklusive prostata 3,4, lever 5,6, mage 7,8,9, bukspottkörtel10, bröstkörtel11 och lunga 12,13 . Dessa ASC-härledda organoider behöll de kritiska cellulära, strukturella och funktionella egenskaperna hos det inhemska organet och upprätthöll genetisk och fenotypisk stabilitet i långsiktig expansionskultur 14,15.
Organoider kan också härledas från pluripotenta stamceller (PSC), inklusive embryonala stamceller (ES) och inducerad pluripotent stam (iPS) cell16. Medan PSC-härledda organoider utnyttjar mekanismerna för organutveckling för deras etablering, kan ASC tvingas att bilda organoider genom att återuppbygga förhållanden som efterliknar stamcellsnischen under fysiologisk vävnadsförnyelse eller vävnadsreparation. PSC-härledda organoider är gynnsamma modeller för att utforska utveckling och organogenes, även om de inte kan nå den jämförbara mognadsnivån för ASC-härledda organoider. Den fosterliknande mognadsstatusen för PSC-härledda organoider och komplexiteten för att etablera dessa organoider förhindrar väsentligt deras breda tillämpningar för att studera biologi och patologi i mogna vävnader.
Den mänskliga luftvägarna, från näsa till terminal bronkiol, är fodrad med luftvägsepitelet, även kallat det pseudostratifierade cilierade epitelet, som består av fyra huvudcelltyper, dvs cilierad cell, bägarecell, basalcell och klubbcell. Vi etablerade den ASC-härledda mänskliga lungorganoiden från mänskliga lungvävnader i samarbete med Clevers lab12,13. Dessa lungorganoider expanderas i följd i expansionsmediet i över ett år; den exakta varaktigheten varierar mellan olika organoidlinjer erhållna från olika givare. Men jämfört med det inhemska luftvägsepitelet är dessa långsiktiga expanderbara lungorganoider inte tillräckligt mogna eftersom cilierade celler, den största cellpopulationen i den mänskliga luftvägarna, är underrepresenterade i dessa lungorganoider. Således utvecklade vi ett proximalt differentieringsprotokoll och genererade 3D- och 2D-luftvägsorganoider som morfologiskt och funktionellt fenoskopierar luftvägsepitelet till en nästan fysiologisk nivå.
Här tillhandahåller vi ett videoprotokoll för att härleda mänskliga lungorganoider från de primära lungvävnaderna, expandera lungorganoiderna och inducera proximal differentiering för att generera 3D- och 2D-luftvägsorganoider.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mänskliga luftvägarna är fodrade med luftvägsepitelet, även känt som det pseudostratifierade cilierade epitelet. De viktigaste celltyperna i det övre luftvägsepitelet är cilierade celler som möjliggör den samordnade rörelsen av deras apikala cilia för att driva ut slem och inhalerade partiklar från luftvägarna, bägare celler som producerar och utsöndrar slem och basala celler som kantar källarmembranet och är inblandade i regenerering. I de små luftvägarna som bronkioler innehåller det kuboidala …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Center of PanorOmic Sciences and Electron Microscope Unit, Li Ka Shing Medicinska fakulteten, University of Hong Kong, för hjälp med konfokal avbildning och flödescytometri. Detta arbete stöddes delvis av finansiering från Health and Medical Research Fund (HMRF, 17161272 and 19180392) från Food and Health Bureau; Forskningsbidragsrådets allmänna forskningsfond (GRF, 17105420); och Health@InnoHK, innovations- och teknikkommissionen, regeringen i den särskilda administrativa regionen Hongkong.
Materials
| Reagents for lung organoid culture | |||
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634010 | – |
| A8301 | Tocris | 2939 | 500nM |
| B27 supplement | Invitrogen | 17504-044 | 1x |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix, Type 2 (BME 2) | Trevigen | 3533-010-0 | 70-80% |
| FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 20 ng/mL |
| FGF-7 | Peprotech | 100-19 | 5 ng/mL |
| GlutaMAX (glutamine) | Invitrogen | 35050061 | 1x |
| HEPES 1M | Invitrogen | 15630-056 | 10 mM |
| Heregulin β-1 | Peprotech | 100-03 | 5 nM |
| N-Acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | 1.25 mM |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | 10 mM |
| Noggin (conditional medium) | home made | – | 10x |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Invitrogen | 15140-122 | 1x |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µg/mL |
| Rspondin1 (conditional medium) | home made | – | 10x |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | 1 µM |
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 5 µM |
| Proximal differentiation medium | |||
| DAPT | Tocris | 2634 | 10 µM |
| Heparin Solution | StemCell Technology | 7980 | 4 µg/mL |
| Hydrocortisone Stock Solution | StemCell Technology | 7925 | 1 µM |
| PneumaCult-ALI 10X Supplement | air liquid interface supplement | ||
| PneumaCult-ALI Basal Medium | StemCell Technology | 05001 | air liquid interface basal medium |
| PneumaCult-ALI Maintenance Supplement | air liquid interface maintenance supplement | ||
| Y-27632 | Tocris | 1254 | 10 µM |
| Equipment | |||
| Biological safety cabinet | Baker | 1-800-992-2537 | |
| Carl Zeiss LSM 780 or 800 | Zeiss | confocal microscope | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 42093483 | |
| Stereo-microscope | Olympus Corporation | CKX31SF | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5418BG040397 | |
| Serological pipettor | Eppendorf | ||
| Micropipette | Eppendorf | ||
| ZEN black or ZEN blue software | Zeiss | analysis software | |
| Consumables | |||
| 12mm Trans-well | StemCell Technology | #38023 | |
| 12-well cell culture plate | Cellstar | 665970 | |
| 15- and 50 ml conical tubes | Thermo Fisher Scientific | L6BF5Z8118 | |
| 24-well cell culture plate | Cellstar | 662160 | |
| 6.5mm Trans-well | StemCell Technology | #38024 | |
| Medical Syringe Filter Unit, 0.22 µm | Sigma-Aldrich | SLGPR33RB | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | ||
| Micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | TFLR140-200-Q21190531 | |
| Pasteur pipette glass | Thermo Fisher Scientific | 22-378893 | |
| Serological pipettes(5ml, 10ml, 25ml) | Thermo Fisher Scientific | BA08003, 08004, 08005 | |
| Antibodies | |||
| Goat Anti-Mouse Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | |
| Goat Anti-Mouse, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11034 | |
| Goat Anti-Rabbit Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11037 | |
| Goat Anti-Rat Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11007 | |
| Mouse Anti-Cytokeratin 5 | Abcam | ab128190 | |
| Mouse Anti-FOX J1 | Invitrogen | 14-9965-82 | |
| Mouse Anti-Mucin 5AC | Abcam | ab3649 | |
| Mouse Anti-β-tubulin 4 | Sigma | T7941 | |
| Rabbit Anti-p63 | Abcam | ab124762 | |
| Rat Anti-Uteroglobin/CC-10 | R&D Systems | MAB4218-SP | |
| Other reagent | |||
| TrypLE Select Enzyme (10X) | Thermo Fisher Scientific | A1217701 | dissociation enzyme |
Riferimenti
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett’s epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
- Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (10), 951-954 (2014).
- Hu, H., et al. Long-term expansion of functional mouse and human hepatocytes as 3D organoids. Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).
- Huch, M., et al. In vitro expansion of single Lgr5+ liver stem cells induced by Wnt-driven regeneration. Nature. 494 (7436), 247-250 (2013).
- Schlaermann, P., et al. A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro. Gut. 65 (2), 202-213 (2016).
- Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136 (2015).
- Wroblewski, L. E., et al. Helicobacter pylori targets cancer-associated apical-junctional constituents in gastroids and gastric epithelial cells. Gut. 64 (5), 720-730 (2015).
- Huch, M., et al. Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis. The EMBO Journal. 32 (20), 2708-2721 (2013).
- Sachs, N., et al. A living biobank of breast cancer organoids captures disease heterogeneity. Cell. 172 (1-2), 373-386 (2018).
- Sachs, N., et al. Long-term expanding human airway organoids for disease modeling. The EMBO Journal. 38 (4), 100300 (2019).
- Zhou, J., et al. Differentiated human airway organoids to assess infectivity of emerging influenza virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (26), 6822-6827 (2018).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. Organoids as an in vitro model of human development and disease. Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).
- Lancaster, M. A., Huch, M. Disease modelling in human organoids. Disease Model Mechanisms. 12 (7), (2019).
- . Millicell ERS-2 User Guide Available from: https://www.merckmillipore.com/HK/en/life-science-research/cell-culture-systems/cell-analysis/millicell-ers-2-voltohmmeter/FiSb.qB.LDgAAAFBdMhb3.r5 (2021)
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. eLife. 4, 05098 (2015).
- Dye, B. R., Miller, A. J., Spence, J. R. How to grow a lung: Applying principles of developmental biology to generate lung lineages from human pluripotent stem cells. Current Pathobiology Reports. 4, 47-57 (2016).
- Glinka, A., et al. LGR4 and LGR5 are R-spondin receptors mediating Wnt/beta-catenin and Wnt/PCP signalling. EMBO Reports. 12 (10), 1055-1061 (2011).
- Groppe, J., et al. Structural basis of BMP signalling inhibition by the cystine knot protein Noggin. Nature. 420 (6916), 636-642 (2002).
- Tadokoro, T., Gao, X., Hong, C. C., Hotten, D., Hogan, B. L. BMP signaling and cellular dynamics during regeneration of airway epithelium from basal progenitors. Development. 143 (5), 764-773 (2016).
- Mou, H., et al. Dual SMAD signaling inhibition enables long-term expansion of diverse epithelial basal cells. Cell Stem Cell. 19 (2), 217-231 (2016).
- Balasooriya, G. I., Goschorska, M., Piddini, E., Rawlins, E. L. FGFR2 is required for airway basal cell self-renewal and terminal differentiation. Development. 144 (9), 1600-1606 (2017).
- Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nature Reviews. Immunology. 20 (5), 279-293 (2019).
- Drost, J., Clevers, H. Translational applications of adult stem cell-derived organoids. Development. 144 (6), 968-975 (2017).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Zhou, J., et al. Infection of bat and human intestinal organoids by SARS-CoV-2. Nature Medicine. 26 (7), 1077-1083 (2020).
- Salahudeen, A. A., et al. Progenitor identification and SARS-CoV-2 infection in human distal lung organoids. Nature. 588 (7839), 670-675 (2020).
- Han, Y., et al. Identification of SARS-CoV-2 inhibitors using lung and colonic organoids. Nature. 589 (7841), 270-275 (2020).
- Mykytyn, A. Z., et al. SARS-CoV-2 entry into human airway organoids is serine protease-mediated and facilitated by the multibasic cleavage site. eLife. 10, 64508 (2021).
- Jacob, F., et al. Human pluripotent stem cell-derived neural cells and brain organoids reveal SARS-CoV-2 neurotropism predominates in choroid plexus epithelium. Cell Stem Cell. 27 (6), 937-950 (2020).
- Lamers, M. M., et al. SARS-CoV-2 productively infects human gut enterocytes. Science. 369 (6499), 50-54 (2020).
- Mallapaty, S. The mini lungs and other organoids helping to beat COVID. Nature. 593 (7860), 492-494 (2021).
