علم الوراثة العكسي لهندسة متغيرات فيروس الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي
Summary
يصف البروتوكول طريقة لإدخال التنوع الجيني الذي يمكن التحكم فيه في جينوم فيروس التهاب الكبد C من خلال الجمع بين تخليق الحمض النووي الريبي الطافر كامل الطول باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ وعلم الوراثة العكسي. توفر الطريقة نموذجا لاختيار النمط الظاهري ويمكن استخدامها لجينومات فيروس الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي التي يبلغ طولها 10 كيلوبايت.
Abstract
أدى عدم وجود طريقة ملائمة للتوليد التكراري للمتغيرات الفيروسية المتنوعة كاملة الطول إلى إعاقة دراسة التطور الموجه في فيروسات الحمض النووي الريبي. من خلال دمج تفاعل البوليميراز المتسلسل الكامل المعرض لخطأ جينوم الحمض النووي الريبي وعلم الوراثة العكسي ، يمكن إحداث طفرات استبدال عشوائية على مستوى الجينوم. لقد طورنا طريقة باستخدام هذه التقنية لتجميع مكتبات متنوعة لتحديد الطفرات الفيروسية ذات الأنماط الظاهرية ذات الاهتمام. وتوفر هذه الطريقة، التي تسمى تخليق الحمض النووي الريبي الطافر الكامل الطول (FL-MRS)، المزايا التالية: (أ) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ب) القدرة على إنشاء مكتبة كبيرة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) عالي الكفاءة من خطوة واحدة عرضة للخطأ؛ (ج) القدرة على (ii) القدرة على إنشاء مجموعات من المكتبات بمستويات متفاوتة من التنوع الجيني عن طريق التلاعب بإخلاص بوليميراز الحمض النووي؛ (iii) إنشاء منتج PCR كامل الطول يمكن أن يكون بمثابة نموذج مباشر لتخليق الحمض النووي الريبي الطافر ؛ و (iv) القدرة على إنشاء الحمض النووي الريبي الذي يمكن تسليمه إلى الخلايا المضيفة كتجمع إدخال غير محدد لفحص الطفرات الفيروسية للنمط الظاهري المطلوب. لقد وجدنا ، باستخدام نهج الوراثة العكسية ، أن FL-MRS هي أداة موثوقة لدراسة التطور الموجه للفيروسات في جميع مراحل دورة حياة فيروس التهاب الكبد C ، عزل JFH1. يبدو أن هذه التقنية أداة لا تقدر بثمن لتوظيف التطور الموجه لفهم التكيف والتكرار ودور الجينات الفيروسية في التسبب في المرض والمقاومة المضادة للفيروسات في فيروسات الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي.
Introduction
يبدأ الفحص الجيني الأمامي بنمط ظاهري فيروسي مثير للاهتمام ، ثم ، من خلال تسلسل جينومه ومقارنته بجينوم السلالة الأصلية ، يحاول تحديد الطفرة (الطفرات) التي تسبب هذا النمط الظاهري. في المقابل ، في الشاشات الجينية العكسية ، يتم إدخال طفرات عشوائية في الجين المستهدف ، يليها فحص النمط الظاهري (الأنماط الظاهرية) الناتج1. بالنسبة لنهج الوراثة العكسية ، فإن الطفرات في المختبر هي التقنية الأكثر استخداما لإنشاء مجموعة من المتغيرات التي يتم فحصها لاحقا بحثا عن الأنماط الظاهرية ذات الأهمية. تم الإبلاغ عن أدوات وراثية مختلفة لتحقيق طفرات عشوائية على مستوى الجينوم لفيروسات الحمض النووي الريبي ، بما في ذلك تفاعل البوليميراز المتسلسل المعرض للخطأ (ep-PCR) 2,3 ، وتمديد البلمرةالدائري 4 ، وطفرات إدخال Mu-transposon 5،6،7. تنتج الطريقتان الأخيرتان مكتبات تؤوي تنوعا محدودا في التسلسل وهي عرضة لإدخال عمليات إدراج وحذف كبيرة ، وهي قاتلة للغاية للفيروسات وتحد بشدة من استعادة المتغيرات الفيروسية المعدية.
EP-PCR هي تقنية طفرات قوية معروفة تستخدم على نطاق واسع في هندسة البروتين لتوليد إنزيمات متحولة لاختيار الأنماط الظاهرية ذات الخصائص المرغوبة ، مثل الاستقرار الحراري المعزز ، وخصوصية الركيزة ، والنشاط التحفيزي8،9،10. هذه التقنية سهلة التنفيذ لأنها تتطلب معدات بسيطة ، ولا تنطوي على معالجات مملة ، وتستخدم الكواشف المتاحة تجاريا ، وهي سريعة ؛ علاوة على ذلك ، فإنه يولد مكتبات عالية الجودة.
هنا ، قمنا بتطوير طريقة جديدة لتخليق الحمض النووي الريبي الطافر الكامل الطول (FL-MRS) لتوليد جينومات كاملة لفيروس التهاب الكبد الوبائي سي (HCV) من خلال دمج ep-PCR ، والذي يحفز الطفرات البديلة العشوائية على مستوى الجينوم وعلم الوراثة العكسي. حتى إدخال أو حذف نيوكليوتيدات واحدة ضار للغاية لفيروسات الحمض النووي الريبي ذات الحس الإيجابي ([+]ssRNA) ؛ ومن ثم ، فإن الطفرات البديلة القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل هي الطريقة المفضلة للتوليد التكراري للمكتبات الكبيرة والمتنوعة من جينومات فيروس الحمض النووي الريبي (+) ss الكاملة ذات الصلاحية الجيدة.
FL-MRS هو نهج مباشر يمكن تطبيقه على أي فيروس RNA ذو إحساس إيجابي بطول جينوم ~ 10 كيلو بايت من خلال التصميم الدقيق لمجموعة التمهيدي التي ترتبط باستنساخ cDNA الفيروسي. pJFH1 هو استنساخ cDNA معدي يشفر النمط الجيني HCV 2a ويمكنه تلخيص جميع خطوات دورة حياة الفيروس. باستخدام نهج FL-MRS ، أظهرنا توليف مكتبات الجينوم الكامل المطفرة عشوائيا (المكتبات الطافرة [MLs]) لإنتاج متغيرات JFH1 ذات الكفاءة المتماثلة والتي لم تكن هناك معرفة مسبقة بالخصائص المرتبطة بالطفرات. عند التعرض لمضاد للفيروسات ، تغلبت بعض المتغيرات الفيروسية بسرعة على ضغط الدواء مع التغيير الظاهري المطلوب. باستخدام البروتوكول الموصوف هنا ، يمكن إنشاء عدد كبير من المتغيرات الفيروسية ، مما يخلق فرصا لدراسة تطور فيروسات ssRNA (+).
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه الدراسة ، قمنا بتفصيل إجراء FL-MRS بسيط وسريع يدمج ep-PCR18 وعلم الوراثة العكسي لتوليف مكتبات الجينوم الكامل HCV ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك في نظام زراعة الخلايا لتوليد متغيرات مختصة بالتكرار لفحص الأنماط الظاهرية المقاومة للأدوية. يعد استخدام Taq DNA polymerase منخفض الدقة شرطا ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تقديم الدعم التمويلي (رقم المنحة BT / PR10906 / MED / 29/860/2014) لهذه الدراسة من قبل وزارة التكنولوجيا الحيوية ، حكومة الهند.
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -. J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
