Genetica inversa per ingegnerizzare varianti virali a RNA a senso positivo

Summary

Il protocollo descrive un metodo per introdurre la diversità genetica controllabile nel genoma del virus dell’epatite C combinando la sintesi di RNA mutante a lunghezza intera utilizzando la PCR soggetta a errori e la genetica inversa. Il metodo fornisce un modello per la selezione del fenotipo e può essere utilizzato per genomi di virus a RNA a senso positivo lunghi 10 kb.

Abstract

La mancanza di un metodo conveniente per la generazione iterativa di diverse varianti virali a lunghezza intera ha impedito lo studio dell’evoluzione diretta nei virus a RNA. Integrando una PCR a RNA a base di errore del genoma completo e la genetica inversa, è possibile indurre una mutagenesi di sostituzione casuale a livello di genoma. Abbiamo sviluppato un metodo che utilizza questa tecnica per sintetizzare diverse librerie per identificare mutanti virali con fenotipi di interesse. Questo metodo, chiamato sintesi di RNA mutante a lunghezza intera (FL-MRS), offre i seguenti vantaggi: (i) la capacità di creare una grande libreria tramite una PCR altamente efficiente in una sola fase soggetta a errori; (ii) la capacità di creare gruppi di librerie con diversi livelli di diversità genetica manipolando la fedeltà della DNA polimerasi; (iii) la creazione di un prodotto di PCR full-length che possa fungere direttamente da modello per la sintesi di RNA mutante; e (iv) la capacità di creare RNA che può essere consegnato nelle cellule ospiti come pool di input non selezionato per lo screening di mutanti virali del fenotipo desiderato. Abbiamo scoperto, utilizzando un approccio di genetica inversa, che FL-MRS è uno strumento affidabile per studiare l’evoluzione virale-diretta in tutte le fasi del ciclo di vita del virus dell’epatite C, JFH1 isolato. Questa tecnica sembra essere uno strumento inestimabile per impiegare l’evoluzione diretta per comprendere l’adattamento, la replicazione e il ruolo dei geni virali nella patogenesi e nella resistenza antivirale nei virus a RNA a senso positivo.

Introduction

Lo screening genetico in avanti inizia con un fenotipo virale di interesse e poi, attraverso il sequenziamento del suo genoma e il confronto con quello del ceppo originale, tenta di identificare la mutazione o le mutazioni che causano quel fenotipo. Al contrario, negli screening genetici inversi, vengono introdotte mutazioni casuali in un gene bersaglio, seguite da un esame del fenotipo o dei fenotipi ^risultanti1. Per l’approccio di genetica inversa, la mutagenesi in vitro è la tecnica più utilizzata per creare un pool di varianti che vengono successivamente sottoposte a screening per i fenotipi di interesse. Sono stati descritti vari strumenti genetici per ottenere la mutagenesi casuale a livello di genoma dei virus a RNA, tra cui la PCR soggetta a errore (ep-PCR)^2,3, l’estensione circolare della polimerasi⁴ e la mutagenesi da inserzione di Mu-trasposone 5,6,7. Gli ultimi due metodi producono librerie che ospitano una limitata diversità di sequenza e sono inclini all’introduzione di grandi inserzioni e delezioni, che sono altamente letali per i virus e limitano gravemente il recupero delle varianti virali infettive.

ep-PCR è una potente tecnica di mutagenesi ben nota ampiamente utilizzata nell’ingegneria proteica per generare enzimi mutanti per la selezione di fenotipi con proprietà desiderate, come una maggiore stabilità termica, specificità del substrato e attività catalitica 8,9,10. Questa tecnica è facile da eseguire perché richiede un’attrezzatura semplice, non comporta noiose manipolazioni, utilizza reagenti disponibili in commercio ed è veloce; Inoltre, genera librerie di alta qualità.

Qui, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la sintesi di RNA mutante a lunghezza intera (FL-MRS) per generare genomi completi del virus dell’epatite C (HCV) integrando ep-PCR, che induce mutagenesi di sostituzione casuale a livello di genoma e genetica inversa. Anche l’inserzione o la delezione di un singolo nucleotide è altamente deleteria per i virus a RNA a senso positivo ([+]ssRNA); quindi, la mutagenesi di sostituzione basata sulla PCR è il metodo preferito per la generazione iterativa di librerie ampie e diversificate di genomi di virus a RNA completi (+)ss con buona vitalità.

FL-MRS è un approccio semplice che può essere applicato a qualsiasi virus a RNA a senso positivo con una lunghezza del genoma di ~10 kb attraverso la progettazione meticolosa di un set di primer che si lega al clone di cDNA virale. pJFH1 è un clone di cDNA infettivo che codifica per il genotipo 2a dell’HCV e può ricapitolare tutte le fasi del ciclo di vita del virus. Utilizzando l’approccio FL-MRS, abbiamo dimostrato la sintesi di librerie di genoma completo mutagenizzate in modo casuale (librerie mutanti [ML]) per produrre varianti di JFH1 competenti per la replicazione per le quali non vi era alcuna conoscenza preliminare delle proprietà associate alle mutazioni. Dopo l’esposizione a un antivirale, alcune delle varianti virali hanno rapidamente superato la pressione del farmaco con il cambiamento fenotipico desiderato. Utilizzando il protocollo qui descritto, è possibile generare una pletora di varianti virali, creando opportunità per studiare l’evoluzione dei virus (+)ssRNA.

Protocol

NOTA: Il ceppo JFH1 (WT) utilizzato qui è stato un gentile regalo di Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. La linea cellulare di epatoma umano, Huh7.5, è stata un gentile regalo di Charles Rice, della Rockefeller University. Uno schema del metodo è mostrato nella Figura 1. 1. Mutagenesi da sostituzione genomica di JFH1 mediante PCR a rischio di errore Per eseguire la ep-PCR, preparare la miscela master per quattro …

Representative Results

Una pletora di varianti complete di HCV può essere generata e sottoposta a screening per i fenotipi resistenti ai farmaci di interesse seguendo le procedure descritte nella Figura 1. Le librerie mutanti dell’intero genoma sono state sintetizzate utilizzando clonal-pJFH1 in quantità decrescenti (100-10 ng), come mostrato nella Figura 2. Le rese medie dei prodotti ep-PCR (librerie mutanti) variavano da 3,8 a 12,5 ng/μL. La Figura 3…

Discussion

In questo studio, abbiamo dettagliato una procedura FL-MRS semplice e rapida che integra ep-PCR¹⁸ e genetica inversa per sintetizzare librerie di genoma completo dell’HCV, che possono quindi essere utilizzate in un sistema di coltura cellulare per generare varianti competenti per la replicazione per lo screening di fenotipi resistenti ai farmaci. L’uso della Taq DNA polimerasi a bassa fedeltà è un prerequisito della ep-PCR che consente l’incorporazione di sostituzioni durante l’amplificazione PC…

Materials

1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 – 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S