양성 RNA 바이러스 변이체를 엔지니어링하기 위한 역유전학
Summary
이 프로토콜은 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 사용하여 전장 돌연변이 RNA 합성을 결합하여 C형 간염 바이러스 게놈에 제어 가능한 유전적 다양성을 도입하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 표현형 선택을 위한 모델을 제공하며 10kb 길이의 양성 감지 RNA 바이러스 게놈에 사용할 수 있습니다.
Abstract
다양한 전장 바이러스 변이체의 반복 생성을 위한 편리한 방법이 없기 때문에 RNA 바이러스의 유도 진화 연구가 방해를 받고 있습니다. 전체 RNA 게놈 오류가 발생하기 쉬운 PCR과 역유전학을 통합함으로써 무작위 게놈 전체 치환 돌연변이 유발을 유도할 수 있습니다. 우리는 이 기술을 사용하여 다양한 라이브러리를 합성하여 관심 표현형을 가진 바이러스 돌연변이를 식별하는 방법을 개발했습니다. 전장 돌연변이 RNA 합성(FL-MRS)이라고 하는 이 방법은 다음과 같은 이점을 제공합니다: (i) 매우 효율적인 원스텝 오류가 발생하기 쉬운 PCR을 통해 대규모 라이브러리를 생성할 수 있는 능력; (ii) DNA 중합효소의 충실도를 조작하여 다양한 수준의 유전적 다양성을 가진 라이브러리 그룹을 만드는 능력; (iii) 돌연변이 RNA 합성을 위한 주형으로서 직접 작용할 수 있는 전장 PCR 산물의 생성; (iv) 원하는 표현형의 바이러스 돌연변이를 스크리닝하기 위해 선택되지 않은 입력 풀로 숙주 세포에 전달될 수 있는 RNA를 생성하는 능력. 우리는 역유전학 접근법을 사용하여 FL-MRS가 C형 간염 바이러스인 JFH1 분리물의 수명 주기의 모든 단계에서 바이러스 지향 진화를 연구할 수 있는 신뢰할 수 있는 도구라는 것을 발견했습니다. 이 기술은 양성 RNA 바이러스의 발병 기전 및 항바이러스 내성에서 바이러스 유전자의 적응, 복제 및 역할을 이해하기 위해 유도 진화를 사용하는 데 매우 유용한 도구인 것으로 보입니다.
Introduction
전방 유전자 스크리닝은 관심 있는 바이러스 표현형으로 시작한 다음 게놈의 염기서열을 분석하고 원래 균주의 표현형과 비교하여 해당 표현형을 유발하는 돌연변이를 식별하려고 시도합니다. 대조적으로, 역 유전자 스크리닝에서는 표적 유전자에 무작위 돌연변이가 도입된 후 결과 표현형을 검사합니다1. 역유전학 접근법의 경우, 시험관 내 돌연변이 유발은 관심 표현형을 연속적으로 스크리닝하는 변이체 풀을 만드는 데 가장 널리 사용되는 기술입니다. 오류가 발생하기 쉬운 PCR(ep-PCR)2,3, 원형 중합효소 확장4 및 Mu-transposon 삽입 돌연변이 유발 5,6,7을 포함하여 RNA 바이러스의 게놈 전체 무작위 돌연변이 유발을 달성하기 위한 다양한 유전 도구가 보고되었습니다. 후자의 두 가지 방법은 제한된 염기서열 다양성을 가진 라이브러리를 생성하고 바이러스에 매우 치명적이며 감염성 바이러스 변이체의 회복을 심각하게 제한하는 대규모 삽입 및 결실이 도입되기 쉽습니다.
ep-PCR은 향상된 열 안정성, 기질 특이성 및 촉매 활성 8,9,10과 같은 원하는 특성을 가진 표현형을 선택하기 위한 돌연변이 효소를 생성하기 위해 단백질 공학에서 널리 사용되는 잘 알려진 강력한 돌연변이 유발 기술입니다. 이 기술은 간단한 장비가 필요하고 지루한 조작이 필요하지 않으며 상업적으로 이용 가능한 시약을 사용하고 빠르기 때문에 수행하기 쉽습니다. 또한 고품질 라이브러리를 생성합니다.
여기서는 무작위 게놈 전체 치환 돌연변이 유발 및 역유전학을 유도하는 ep-PCR을 통합하여 C형 간염 바이러스(HCV)의 완전한 게놈을 생성하는 전장 돌연변이 RNA 합성(FL-MRS)을 위한 새로운 방법을 개발했습니다. 단일 뉴클레오티드 삽입 또는 결실조차도 양성 감지 RNA 바이러스([+]ssRNA)에 매우 해롭습니다. 따라서 PCR 기반 치환 돌연변이 유발은 생존력이 우수한 전체 (+)ss RNA 바이러스 게놈의 크고 다양한 라이브러리의 반복 생성에 선호되는 방법입니다.
FL-MRS는 바이러스 cDNA 클론에 결합하는 프라이머 세트의 세심한 설계를 통해 ~10kb 게놈 길이의 모든 양성 RNA 바이러스에 적용할 수 있는 간단한 접근 방식입니다. pJFH1은 HCV 유전자형 2a를 암호화하고 바이러스 수명 주기의 모든 단계를 재현할 수 있는 감염성 cDNA 클론입니다. FL-MRS 접근법을 사용하여 무작위로 돌연변이화된 전체 게놈 라이브러리(돌연변이 라이브러리[ML])를 합성하여 돌연변이와 관련된 특성에 대한 사전 지식이 없는 복제 가능한 JFH1 변이체를 생성하는 것을 입증했습니다. 항바이러스제에 노출된 일부 바이러스 변이체는 원하는 표현형 변화로 약물 압력을 빠르게 극복했습니다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하면 과다한 바이러스 변이체를 생성할 수 있어 (+)ssRNA 바이러스의 진화를 연구할 수 있는 기회를 얻을 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서는 HCV 전체 게놈 라이브러리를 합성하기 위해 ep-PCR18 과 역 유전학을 통합하는 간단하고 빠른 FL-MRS 절차를 자세히 설명했으며, 이는 세포 배양 시스템에서 약물 내성 표현형 스크리닝을 위한 복제 가능한 변이체를 생성하는 데 사용할 수 있습니다. 저충실도 Taq DNA 중합효소의 사용은 전체 길이 바이러스 게놈의 PCR 증폭 중에 치환을 통합할 수 있는 ep-PCR의 전제 조건입…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구에 대한 자금 지원(보조금 번호 BT/PR10906/MED/29/860/2014)은 인도 정부 생명공학부에서 제공했습니다.
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
Riferimenti
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