Omvendt genetikk for å konstruere RNA-virusvarianter med positiv følelse

Summary

Protokollen beskriver en metode for å introdusere kontrollerbart genetisk mangfold i hepatitt C-virusgenomet ved å kombinere full lengde mutant RNA-syntese ved hjelp av feilutsatt PCR og omvendt genetikk. Metoden gir en modell for fenotypeseleksjon og kan brukes til 10 kb lange positive sense RNA-virusgenomer.

Abstract

Mangelen på en praktisk metode for iterativ generering av forskjellige virusvarianter i full lengde har hindret studiet av rettet evolusjon i RNA-virus. Ved å integrere en full RNA-genomfeilutsatt PCR og omvendt genetikk, kan tilfeldig genom-bred substitusjonsmutagenese induseres. Vi har utviklet en metode ved hjelp av denne teknikken for å syntetisere forskjellige biblioteker for å identifisere virale mutanter med fenotyper av interesse. Denne metoden, kalt full lengde mutant RNA-syntese (FL-MRS), gir følgende fordeler: (i) evnen til å lage et stort bibliotek via en svært effektiv ett-trinns feilutsatt PCR; (ii) evnen til å skape grupper av biblioteker med varierende nivåer av genetisk mangfold ved å manipulere troskapen til DNA-polymerase; (iii) opprettelsen av et full-lengde PCR-produkt som direkte kan tjene som en mal for mutant RNA-syntese; og (iv) evnen til å lage RNA som kan leveres inn i vertsceller som et ikke-valgt inngangsbasseng for å skjerme for virale mutanter av ønsket fenotype. Vi har funnet, ved hjelp av en omvendt genetikktilnærming, at FL-MRS er et pålitelig verktøy for å studere virusrettet evolusjon i alle stadier i livssyklusen til hepatitt C-viruset, JFH1-isolatet. Denne teknikken ser ut til å være et uvurderlig verktøy for å bruke rettet evolusjon for å forstå tilpasning, replikasjon og rollen som virale gener i patogenese og antiviral resistens i positiv forstand RNA-virus.

Introduction

Fremskutt genetisk screening begynner med en viral fenotype av interesse, og deretter, gjennom sekvensering av genomet og sammenligning med den opprinnelige stammen, forsøker å identifisere mutasjonen (e) som forårsaker den fenotypen. I motsetning til dette, i omvendte genetiske skjermer, blir tilfeldige mutasjoner introdusert i et målgen, etterfulgt av en undersøkelse av den resulterende fenotypen (e)¹. For omvendt genetikk tilnærming er in vitro mutagenese den mest brukte teknikken for å skape et basseng av varianter som deretter screenes for fenotyper av interesse. Ulike genetiske verktøy har blitt rapportert for å oppnå genom-bred tilfeldig mutagenese av RNA-virus, inkludert feilutsatt PCR (ep-PCR) ^2,3, sirkulær polymeraseforlengelse⁴ og Mu-transposon innsetting mutagenese 5,6,7. De to sistnevnte metodene gir biblioteker som har begrenset sekvensmangfold og er utsatt for innføring av store innsettinger og slettinger, som er svært dødelige for virus og sterkt begrenser utvinningen av smittsomme virusvarianter.

ep-PCR er en velkjent kraftig mutageneseteknikk som er mye brukt i proteinteknikk for å generere mutante enzymer for valg av fenotyper med ønskede egenskaper, for eksempel forbedret termisk stabilitet, substratspesifisitet og katalytisk aktivitet ^8,9,10. Denne teknikken er enkel å utføre fordi den krever enkelt utstyr, involverer ikke kjedelige manipulasjoner, bruker kommersielt tilgjengelige reagenser og er rask; Videre genererer det biblioteker av høy kvalitet.

Her utviklet vi en ny metode for full lengde mutant RNA-syntese (FL-MRS) for å generere komplette genomer av hepatitt C-virus (HCV) ved å integrere ep-PCR, som induserer tilfeldig genom-bred substitusjonsmutagenese og omvendt genetikk. Selv en enkelt nukleotidinnsetting eller sletting er svært skadelig for RNA-virus med positiv følelse ([+] ssRNA); Derfor er PCR-basert substitusjonsmutagenese den foretrukne metoden for iterativ generering av store, varierte biblioteker med fulle (+) ss RNA-virusgenomer med god levedyktighet.

FL-MRS er en enkel tilnærming som kan brukes på ethvert RNA-virus med positiv følelse med en ~ 10 kb genomlengde gjennom den omhyggelige utformingen av et primersett som binder seg til den virale cDNA-klonen. pJFH1 er en smittsom cDNA-klon som koder for HCV-genotype 2a og kan rekapitulere alle trinnene i virusets livssyklus. Ved å bruke FL-MRS-tilnærmingen demonstrerte vi syntesen av tilfeldig mutageniserte fullgenombiblioteker (mutantbiblioteker [MLs]) for å produsere replikasjonskompetente JFH1-varianter der det ikke var noen forkunnskaper om egenskapene forbundet med mutasjoner. Ved eksponering for et antiviralt middel overvant noen av virusvariantene raskt medikamenttrykket med ønsket fenotypisk forandring. Ved hjelp av protokollen beskrevet her, kan en mengde virusvarianter genereres, noe som skaper muligheter for å studere utviklingen av (+) ssRNA-virus.

Protocol

MERK: JFH1-stammen (WT) som ble brukt her, var en snill gave fra Takaji Wakita, National Institute of Infectious Diseases. Den menneskelige hepatomcellelinjen, Huh7.5, var en snill gave fra Charles Rice, The Rockefeller University. Et skjema over metoden er vist i figur 1. 1. Genom-bred substitusjonsmutagenese av JFH1 ved bruk av feilutsatt PCR For å utføre ep-PCR, klargjør masterblandingen for fire sett med eksperimenter med primere …

Representative Results

En mengde HCV-varianter i full lengde kan genereres og screenes for medikamentresistente fenotyper av interesse etter prosedyrene beskrevet i figur 1. Fulle genommutantbiblioteker ble syntetisert ved bruk av klonal-pJFH1 i synkende mengder (100-10 ng), som vist i figur 2. Gjennomsnittlig utbytte av ep-PCR-produkter (mutantbiblioteker) varierte fra 3,8-12,5 ng / μL. Figur 3 viser virale transkripsjoner syntetisert fra klonal-pJFH1 o…

Discussion

I denne studien har vi beskrevet en enkel og rask FL-MRS-prosedyre som integrerer ep-PCR¹⁸ og omvendt genetikk for syntetisering av HCV-fullgenombiblioteker, som deretter kan brukes i et cellekultursystem for å generere replikasjonskompetente varianter for screening av stoffresistente fenotyper. Bruken av Taq DNA-polymerase med lav kvalitet er en forutsetning for ep-PCR som tillater inkorporering av substitusjoner under PCR-amplifisering av et viralt genom i full lengde. Vi testet flere Taq DNA-p…

Materials

1 kb plus DNA ladder	Thermo Fisher	10787018
1.5 ml centrifuge tube	Tarsons	500010
15 ml centrifuge tube	Tarsons	546021
35 mm cell culture dish	Tarsons	960010
50 ml centrifuge tube	Tarsons	546041
Acetic acid	Merck	A6283
Agarose	HiMedia	MB080
Agrose gel electrophoresis unit	BioRad	1704406
Biosafety Cabinet, ClassII	ESCO	AC2 4S
Bovine serum albumin	HiMedia	MB083
Centrifuge	Eppendorf	5424-R
CFX Connect Real-Time PCR Detection System	BioRad	1855201
Cloning plates 90 mm	Tarson	460091
CO2 Incubator	New Brunswick	Galaxy 170R
Colibri Microvolume Spectrometer	Titertek-Berthold	11050140
DAB Substrate Kit	Abcam	ab94665
dATP Solution	NEB	N0440S
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	NEB	N0446
Diethyl Pyrocarbonate (DEPC)	SRL chemical	46791
Dimethyl sulphoxide (DMSO)	HiMedia	MB058
DMEM high glucose	Lonza	BE12-604F
EcoR1-HF	NEB	R3101
EDTA tetrasodium salt dihydrate	HiMedia	GRM4918
Ethidium Bromide	Amresco	X328
Fetal bovine serum	Gibco	26140079
Formaldehyde	Fishser Scientific	12755
Gel Documentation System	ALPHA IMAGER
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP	Thermo Fisher	A16066
Hydrogen peroxide 30%	Merck	107209
Inverted microscope	Nickon	ECLIPSE Ts2
LB broth	HiMedia	M1245
Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	116680270	transfection reagent
Mechanical Pipette Set	Eppendorf	3120000909
Methanol	Merck	106009
Micro Tips 0.2-10 µl	Tarsons	521000
Micro Tips 10 – 100 µl	Tarsons	521010
Micro Tips 200-1000 µl	Tarsons	521020
MOPS buffer	GeNei	3601805001730
Nonessential aminoacids (NEAA)	Gibco	11140050
One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli	Invitrogen	C404010	E.coli DH5α
Opti-MEM	Gibco	1105-021	minimal essential medium
PCR tubes 0.2 ml	Tarsons	510051
Pencillin/streptomycin	Gibco	15070063
pGEM-T Easy Vector System	Promega	A1360	T-vector DNA
Phosphate buffer saline (PBS)	HiMedia	TI1099
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Pibrentasvir	Cayman Chemical	27546
Pipette controller	Gilson	F110120
Platinum Taq DNA Polymerase	Thermo	10966034
Prism	GraphPad		statistical analysis software
QIAamp Viral RNA Mini kit	Qiagen	52904	viral isolation kit
QIAprep Spin Miniprep Kit	Qiagen	27106
QIAquick PCR Purification Kit	QIAGEN	28104	cokum purification kit
RNeasy Mini Kit	QIAGEN	74104	RNA cleanup kit
Serological Pipettes 25 ml	Thermo Fisher	170357N
Serological Pipettes 5 ml	Thermo Fisher	170355N
Serological Pipettes10 ml	Thermo Fisher	170356N
Single strand RNA Marker 0.2-10 kb	Merck	R7020
Skim milk	HiMedia	M530
Sodium azide 0.1 M solution	Merck	8591
SuperScript III Reverse Transcriptase	Invitrogen	18080044	reverse transcriptase
T100 Thermal Cycler	BioRad	1861096
T175 cell culture flask	Tarsons	159910
T25 cell culture flask	Tarsons	950040
T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System	Promega	P1320	Large Scale RNA Production System
T75 cell culture flask	Tarsons	950050
Taq DNA Polymerase	Genetix Biotech (Puregene)	PGM040
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Applied Biosystems	4392653
TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit	Thermo Fisher	4392653	commercial qRT-PCR kit
TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K8050-10	kit for cloning of long-PCR product
Tris base	HiMedia	TC072
Trypsin-EDTA solution	HiMedia	TCL007
Tween 20	HiMedia	MB067
Vacuum Concentrator	Eppendorf, Concentrator Plus	100248
Water bath	GRANT	JBN-18
Xba1	NEB	R0145S