Реверсивная генетика для создания вариантов РНК-вируса с положительным смыслом
Summary
В протоколе описан метод введения контролируемого генетического разнообразия в геном вируса гепатита С путем комбинирования полноразмерного синтеза мутантной РНК с использованием подверженной ошибкам ПЦР и обратной генетики. Метод обеспечивает модель селекции фенотипа и может быть использован для геномов вирусов с положительной РНК длиной 10 кб.
Abstract
Отсутствие удобного метода итеративной генерации разнообразных полноразмерных вариантов вируса затрудняет изучение направленной эволюции РНК-содержащих вирусов. Интегрируя ПЦР с полным геномом, подверженным ошибкам, и обратную генетику, можно индуцировать мутагенез случайных замен на уровне генома. Мы разработали метод, использующий эту технику, для синтеза различных библиотек для идентификации вирусных мутантов с фенотипами, представляющими интерес. Этот метод, называемый полноразмерным синтезом мутантной РНК (FL-MRS), обладает следующими преимуществами: (i) возможность создания большой библиотеки с помощью высокоэффективной одноэтапной ПЦР, подверженной ошибкам; (ii) возможность создания групп библиотек с различными уровнями генетического разнообразия путем манипулирования достоверностью ДНК-полимеразы; (iii) создание полноразмерного ПЦР-продукта, который может непосредственно служить матрицей для синтеза мутантной РНК; и (iv) способность создавать РНК, которая может быть доставлена в клетки-хозяина в качестве неотобранного входного пула для скрининга вирусных мутантов желаемого фенотипа. Используя подход обратной генетики, мы обнаружили, что FL-MRS является надежным инструментом для изучения вирусно-направленной эволюции на всех этапах жизненного цикла вируса гепатита С, изолята JFH1. Этот метод, по-видимому, является бесценным инструментом, позволяющим использовать направленную эволюцию для понимания адаптации, репликации и роли вирусных генов в патогенезе и противовирусной резистентности у РНК-вирусов с положительным смыслом.
Introduction
Прямой генетический скрининг начинается с интересующего нас вирусного фенотипа, а затем, путем секвенирования его генома и сравнения его с геномом исходного штамма, предпринимается попытка идентифицировать мутацию (мутации), вызывающую этот фенотип. В отличие от этого, при обратном генетическом скрининге случайные мутации вводятся в ген-мишень с последующим исследованием результирующего фенотипа (фенотипов)1. Для подхода обратной генетики мутагенез in vitro является наиболее широко используемым методом для создания пула вариантов, которые впоследствии проверяются на наличие интересующих фенотипов. Сообщалось о различных генетических инструментах для достижения полногеномного случайного мутагенеза РНК-вирусов, включая подверженную ошибкам ПЦР (ep-PCR)2,3, кольцевое расширение полимеразы4 и мутагенез вставки мю-транспозона 5,6,7. Последние два метода дают библиотеки с ограниченным разнообразием последовательностей и склонны к введению больших вставок и делеций, которые являются очень летальными для вирусов и серьезно ограничивают восстановление инфекционных вариантов вируса.
ep-ПЦР является хорошо известным мощным методом мутагенеза, широко используемым в белковой инженерии для получения мутантных ферментов для селекции фенотипов с желаемыми свойствами, такими как повышенная термическая стабильность, субстратная специфичность и каталитическая активность 8,9,10. Эта методика проста в исполнении, потому что требует простого оборудования, не требует утомительных манипуляций, использует имеющиеся в продаже реагенты и является быстрой; Более того, он генерирует высококачественные библиотеки.
Здесь мы разработали новый метод синтеза полноразмерной мутантной РНК (FL-MRS) для получения полных геномов вируса гепатита С (HCV) путем интеграции ep-PCR, которая индуцирует мутагенез случайных замещений по всему геному и обратную генетику. Даже вставка или делеция одного нуклеотида крайне вредна для вирусов с положительной РНК ([+]ssRNA); следовательно, мутагенез замещения на основе ПЦР является предпочтительным методом для итеративной генерации больших, разнообразных библиотек полных (+)ss РНК вирусных геномов с хорошей жизнеспособностью.
FL-MRS — это простой подход, который может быть применен к любому РНК-вирусу с положительным смыслом и длиной генома ~10 кб благодаря тщательной разработке набора праймеров, который связывается с вирусным клоном кДНК. pJFH1 представляет собой инфекционный клон кДНК, который кодирует генотип вируса гепатита С 2a и может повторять все этапы жизненного цикла вируса. Используя подход FL-MRS, мы продемонстрировали синтез случайно мутагенизированных полногеномных библиотек (мутантных библиотек [ML]) для получения репликационно-компетентных вариантов JFH1, для которых не было предварительных знаний о свойствах, связанных с мутациями. При воздействии противовирусного препарата некоторые из вариантов вируса быстро преодолевали лекарственное давление с желаемым фенотипическим изменением. Используя описанный здесь протокол, можно создать множество вариантов вируса, что создает возможности для изучения эволюции (+)ssRNA-вирусов.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом исследовании мы подробно описали простую и быструю процедуру FL-MRS, которая объединяет ep-PCR18 и обратную генетику для синтеза полногеномных библиотек HCV, которые затем могут быть использованы в системе клеточных культур для создания репликационно-компетентных вариант…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансовая поддержка (номер гранта BT/PR10906/MED/29/860/2014) для этого исследования была предоставлена Департаментом биотехнологии правительства Индии.
Materials
| 1 kb plus DNA ladder | Thermo Fisher | 10787018 | |
| 1.5 ml centrifuge tube | Tarsons | 500010 | |
| 15 ml centrifuge tube | Tarsons | 546021 | |
| 35 mm cell culture dish | Tarsons | 960010 | |
| 50 ml centrifuge tube | Tarsons | 546041 | |
| Acetic acid | Merck | A6283 | |
| Agarose | HiMedia | MB080 | |
| Agrose gel electrophoresis unit | BioRad | 1704406 | |
| Biosafety Cabinet, ClassII | ESCO | AC2 4S | |
| Bovine serum albumin | HiMedia | MB083 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424-R | |
| CFX Connect Real-Time PCR Detection System | BioRad | 1855201 | |
| Cloning plates 90 mm | Tarson | 460091 | |
| CO2 Incubator | New Brunswick | Galaxy 170R | |
| Colibri Microvolume Spectrometer | Titertek-Berthold | 11050140 | |
| DAB Substrate Kit | Abcam | ab94665 | |
| dATP Solution | NEB | N0440S | |
| Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set | NEB | N0446 | |
| Diethyl Pyrocarbonate (DEPC) | SRL chemical | 46791 | |
| Dimethyl sulphoxide (DMSO) | HiMedia | MB058 | |
| DMEM high glucose | Lonza | BE12-604F | |
| EcoR1-HF | NEB | R3101 | |
| EDTA tetrasodium salt dihydrate | HiMedia | GRM4918 | |
| Ethidium Bromide | Amresco | X328 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 26140079 | |
| Formaldehyde | Fishser Scientific | 12755 | |
| Gel Documentation System | ALPHA IMAGER | ||
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP | Thermo Fisher | A16066 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Merck | 107209 | |
| Inverted microscope | Nickon | ECLIPSE Ts2 | |
| LB broth | HiMedia | M1245 | |
| Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher | 116680270 | transfection reagent |
| Mechanical Pipette Set | Eppendorf | 3120000909 | |
| Methanol | Merck | 106009 | |
| Micro Tips 0.2-10 µl | Tarsons | 521000 | |
| Micro Tips 10 – 100 µl | Tarsons | 521010 | |
| Micro Tips 200-1000 µl | Tarsons | 521020 | |
| MOPS buffer | GeNei | 3601805001730 | |
| Nonessential aminoacids (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C404010 | E.coli DH5α |
| Opti-MEM | Gibco | 1105-021 | minimal essential medium |
| PCR tubes 0.2 ml | Tarsons | 510051 | |
| Pencillin/streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | T-vector DNA |
| Phosphate buffer saline (PBS) | HiMedia | TI1099 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | M0530S | |
| Pibrentasvir | Cayman Chemical | 27546 | |
| Pipette controller | Gilson | F110120 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Thermo | 10966034 | |
| Prism | GraphPad | statistical analysis software | |
| QIAamp Viral RNA Mini kit | Qiagen | 52904 | viral isolation kit |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | QIAGEN | 28104 | cokum purification kit |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | RNA cleanup kit |
| Serological Pipettes 25 ml | Thermo Fisher | 170357N | |
| Serological Pipettes 5 ml | Thermo Fisher | 170355N | |
| Serological Pipettes10 ml | Thermo Fisher | 170356N | |
| Single strand RNA Marker 0.2-10 kb | Merck | R7020 | |
| Skim milk | HiMedia | M530 | |
| Sodium azide 0.1 M solution | Merck | 8591 | |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | Invitrogen | 18080044 | reverse transcriptase |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| T175 cell culture flask | Tarsons | 159910 | |
| T25 cell culture flask | Tarsons | 950040 | |
| T7 RiboMax Express Large Scale RNA Production System | Promega | P1320 | Large Scale RNA Production System |
| T75 cell culture flask | Tarsons | 950050 | |
| Taq DNA Polymerase | Genetix Biotech (Puregene) | PGM040 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | |
| TaqMan RNA-to-CT 1-Step Kit | Thermo Fisher | 4392653 | commercial qRT-PCR kit |
| TOPO-XL–2 Complete PCR Cloning Kit | Thermo Fisher | K8050-10 | kit for cloning of long-PCR product |
| Tris base | HiMedia | TC072 | |
| Trypsin-EDTA solution | HiMedia | TCL007 | |
| Tween 20 | HiMedia | MB067 | |
| Vacuum Concentrator | Eppendorf, Concentrator Plus | 100248 | |
| Water bath | GRANT | JBN-18 | |
| Xba1 | NEB | R0145S |
References
- Desselberger, U. Reverse genetics of rotavirus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2106-2108 (2017).
- Singh, D., et al. Genome-wide mutagenesis of hepatitis C virus reveals ability of genome to overcome detrimental mutations. Journal of Virology. 94 (3), 01327 (2020).
- Agarwal, S., Baccam, P., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Novel synthesis and phenotypic analysis of mutant clouds for hepatitis E virus genotype 1. Journal of Virology. 92 (4), 01932 (2018).
- Edmonds, J., et al. A novel bacterium-free method for generation of flavivirus infectious DNA by circular polymerase extension reaction allows accurate recapitulation of viral heterogeneity. Journal of Virology. 87 (4), 2367-2372 (2013).
- Arumugaswami, V., et al. High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome. PLoS Pathogens. 4 (10), 1000182 (2008).
- Heaton, N. S., Sachs, D., Chen, C. -. J., Hai, R., Palese, P. Genome-wide mutagenesis of influenza virus reveals unique plasticity of the hemagglutinin and NS1 proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20248-20253 (2013).
- Eyre, N. S., et al. Genome-wide mutagenesis of dengue virus reveals plasticity of the NS1 protein and enables generation of infectious tagged reporter viruses. Journal of Virology. 91 (23), 01455 (2017).
- Cobb, R. E., Chao, R., Zhao, H. Directed evolution: Past, present, and future. AIChE Journal. American Institute of Chemical Engineers. 59 (5), 1432-1440 (2013).
- Sen, S., Venkata Dasu, V., Mandal, B. Developments in directed evolution for improving enzyme functions. Applied Biochemistry and Biotechnology. 143 (3), 212-223 (2007).
- Yuan, L., Kurek, I., English, J., Keenan, R. Laboratory-directed protein evolution. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 69 (3), 373-392 (2005).
- Green, M. R., Sambrook, J. Analysis of DNA by agarose gel electrophoresis. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (1), (2019).
- Desjardins, P., Conklin, D. NanoDrop microvolume quantitation of nucleic acids. Journal of Visualized Experiments. (45), e2565 (2010).
- Rio, D. C. Denaturation and electrophoresis of RNA with formaldehyde. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (2), 219-222 (2015).
- Lindenbach, B. D. Measuring HCV infectivity produced in cell culture and in vivo. Methods in Molecular Biology. 510, 329-336 (2009).
- Lei, C., Yang, J., Hu, J., Sun, X. On the calculation of TCID50 for quantitation of virus infectivity. Virologica Sinica. 36 (1), 141-144 (2021).
- Soni, S., Singh, D., Aggarwal, R., Veerapu, N. S. Enhanced fitness of hepatitis C virus increases resistance to direct-acting antivirals. The Journal of General Virology. 103 (2), (2022).
- Khan, S., Soni, S., Veerapu, N. S. HCV replicon systems: Workhorses of drug discovery and resistance. Frontiers in Cellular Infection Microbiology. 10, 325 (2020).
- Cadwell, R. C., Joyce, G. F. Randomization of genes by PCR mutagenesis. PCR Methods and Applications. 2 (1), 28-33 (1992).
