Vurdering af mitokondriefunktion i iskiasnerven ved respirometri i høj opløsning
Summary
Respirometri med høj opløsning koblet til fluorescenssensorer bestemmer mitokondrie iltforbrug og reaktive iltarter (ROS) generation. Den nuværende protokol beskriver en teknik til at vurdere mitokondrie respiratoriske satser og ROS produktion i den permeabiliserede iskiasnerve.
Abstract
Mitokondrie dysfunktion i perifere nerver ledsager flere sygdomme forbundet med perifer neuropati, som kan udløses af flere årsager, herunder autoimmune sygdomme, diabetes, infektioner, arvelige lidelser og tumorer. Vurdering af mitokondriefunktion i musens perifere nerver kan være udfordrende på grund af den lille prøvestørrelse, et begrænset antal mitokondrier, der er til stede i vævet, og tilstedeværelsen af en myelinskede. Teknikken beskrevet i dette arbejde minimerer disse udfordringer ved at bruge en unik permeabiliseringsprotokol tilpasset fra en, der anvendes til muskelfibre, til at vurdere iskiasnervens mitokondriefunktion i stedet for at isolere mitokondrierne fra vævet. Ved at måle fluorimetrisk reaktiv artsproduktion med Amplex Red/Peroxidase og sammenligne forskellige mitokondrie substrater og inhibitorer i saponinpermeabiliserede nerver var det muligt at detektere mitokondrie respiratoriske tilstande, reaktive iltarter (ROS) og aktiviteten af mitokondriekomplekser samtidigt. Derfor giver metoden, der præsenteres her, fordele i forhold til vurderingen af mitokondriefunktionen ved andre teknikker.
Introduction
Mitokondrier er afgørende for at opretholde celle levedygtighed og udføre talrige cellefunktioner såsom energimetabolisme (glukose, aminosyre, lipid og nukleotid metabolisme veje). Som det primære sted for produktion af reaktive iltarter (ROS) er mitokondrier centrale i flere cellesignaleringsprocesser såsom apoptose og deltager i syntesen af jern-svovl (Fe-S) klynger, mitokondrieproteinimport og modning og vedligeholdelse af deres genom og ribosomer 1,2,3. Mitokondriemembrandynamiknetværket styres af fusions- og fissionsprocesser, og de har også maskiner til kvalitetskontrol ogmitofagi 4,5,6.
Mitokondrie dysfunktion er forbundet med udseendet af flere patologiske tilstande såsom kræft, diabetes og fedme7. Forstyrrelser i mitokondriefunktionen påvises i neurodegenerative lidelser, der påvirker centralnervesystemet, som i Alzheimers sygdom 8,9, Parkinsons sygdom10,11, amyotrofisk lateral sklerose12,13 og Huntingtons sygdom14,15 . I det perifere nervesystem observeres tab af mitokondriefunktion i axoner i immunneuropatier, såsom Guillain-Barré syndrom16,17, og i forbindelse med høj mitokondrie ROS-produktion i axoner fører disse begivenheder til MAP Kinase-aktivering i Schwann-celler18. Dette viser, at mitokondriefysiologi kan være afgørende ikke kun for en stedsspecifik celle, men for et helt væv. I HIV-associeret distal sensorisk polyneuropati (HIV-DSP) har mitokondrier en rolle i den mekanisme, hvormed transaktivatoren af transkriptionsprotein (HIV-TAT) tillader HIV at replikere effektivt, såvel som flere andre roller i HIV-infektionspatogenese19,20.
Evaluering af iskiasnerven mitokondrie fysiologi har vist sig som et væsentligt mål for undersøgelse af neuropati 7,21,22. I diabetisk neuropati tyder proteomiske og metabolomiske analyser på, at de fleste molekylære ændringer i diabetes påvirker iskiasnerven mitokondriel oxidativ phosphorylering og lipidmetabolisme7. Disse ændringer synes også at være tidlige tegn på fedme-induceret diabetes21. I en musemodel af kemoterapi-induceret smertefuld neuropati detekteres mitokondrieforringelse i iskiasnerven som et fald i oxidativ phosphorylering22 og en reduktion af mitokondriekomplekser aktiviteter, membranpotentiale og ATP-indhold23. Selvom flere grupper har citeret mitokondrie dysfunktion i neuropatier, er disse undersøgelser begrænset til målinger af aktivitet i mitokondriekomplekser uden bevarelse af mitokondriemembranerne, manglende evaluering af mitokondrieintegritet eller målinger af ATP-indhold som parameter for mitokondrie-ATP-produktion. Generelt kræver en korrekt vurdering af mitokondrie iltforbrug og ROS-produktion isolering af mitokondrier ved differentiel centrifugering i en percoll / saccharosegradient. Isolering af mitokondrier kan også være en begrænsende faktor for iskiasnervevæv på grund af den store mængde væv, der er nødvendig, og mitokondrier tab og forstyrrelse.
Denne undersøgelse har til formål at tilvejebringe en protokol til måling af mitokondriefysiologi som mitokondrie iltforbrug og ROS-produktion i iskiasnerven, bevare mitokondriemembraner og uden behov for isolering af mitokondrier. Denne protokol er tilpasset fra iltforbrugsmålinger i permeabiliserede muskelfibre24 ved respirometri med høj opløsning (HRR). Fordelene ved denne procedure er muligheden for at evaluere mitokondrier i små mængder væv såsom iskiasnerven og evaluere mitokondrieparametre in situ og derved bevare mitokondriemiljøet, strukturen og den bioenergetiske profil for at opnå et fysiologisk pålideligt resultat. De mitokondrielle respiratoriske tilstande blev bestemt med substrater og hæmmere efter iskiasnervepermeabilitet for korrekt at vurdere mitokondriebioenergetik og cytokrom c-koefficient for mitokondriemembranintegritet, hvilket giver en vejledning til trin i mitokondrieelektrontransportsystemet (ETS) evaluering og beregning af væsentlige parametre. Denne undersøgelse kan give værktøjer til at besvare spørgsmål i patofysiologiske mekanismer, hvor iskiasnervenmetabolisme er impliceret, såsom perifere neuropatier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Flere sygdomme eller tilstande, der ledsager neuropatier, har mitokondrie dysfunktion som en risikofaktor. Evalueringen af mitokondriefunktionen i perifere nerver er afgørende for at belyse, hvordan mitokondrierne virker i disse neurodegenerative tilstande. Vurderingen af mitokondriefunktionen er besværlig på grund af vanskeligheden ved isolationsmetoden og manglen på materiale. Således er udviklingen af vævspermeabiliseringsteknikker, der ikke kræver isolering af mitokondrier, afgørende.
<p class="jove_conte…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev finansieret af Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Vi er taknemmelige for Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli og Dr. Claudio Masuda for støtten med laboratoriefaciliteter og Dr. Martha Sorenson for venlige og værdifulde kommentarer til forbedring af artiklen.
Materials
| Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
| Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
| Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
| Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
| DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
| Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
| EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
| Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
| L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
| Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
| Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
| O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
| O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
| Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
| OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
| Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
| Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
| Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
| Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |
Riferimenti
- Pfanner, N., Warscheid, B., Wiedemann, N. Mitochondrial protein organization: from biogenesis to networks and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (5), 267-284 (2019).
- Sena, L. A., Chandel, N. S. Physiological roles of mitochondrial reactive oxygen species. Molecular Cell. 48 (2), 158-167 (2012).
- Van Der Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetica. 207 (3), 843-871 (2017).
- Rugarli, E. I., Langer, T. Mitochondrial quality control: A matter of life and death for neurons. EMBO Journal. 31 (6), 1336-1349 (2012).
- Westermann, B. Mitochondrial fusion and fission in cell life and death. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 872-884 (2010).
- Pickles, S., Vigié, P., Youle, R. J. Mitophagy and quality control mechanisms in mitochondrial maintenance. Current Biology. 28 (4), 170-185 (2018).
- Freeman, O. J., et al. Metabolic dysfunction is restricted to the sciatic nerve in experimental diabetic neuropathy. Diabetes. 65 (1), 228-238 (2016).
- Sheng, B., et al. Impaired mitochondrial biogenesis contributes to mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Journal of Neurochemistry. 120 (3), 419-429 (2012).
- Wang, X., et al. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction in Alzheimer’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1842 (8), 1240-1247 (2014).
- Li, W., Fu, Y. H., Halliday, G. M., Sue, C. M. PARK genes link mitochondrial dysfunction and alpha-synuclein pathology in sporadic Parkinson’s disease. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 1-11 (2021).
- Winklhofer, K. F., Haass, C. Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease. Biochimica et Biophysica Acta – Molecular Basis of Disease. 1802 (1), 29-44 (2010).
- Harley, J., Clarke, B. E., Patani, R. The interplay of rna binding proteins, oxidative stress and mitochondrial dysfunction in ALS. Antioxidants. 10 (4), 552 (2021).
- Nakagawa, Y., Yamada, S. A novel hypothesis on metal dyshomeostasis and mitochondrial dysfunction in amyotrophic lateral sclerosis: Potential pathogenetic mechanism and therapeutic implications. European Journal of Pharmacology. 892, 173737 (2021).
- Franco-Iborra, S., et al. Mutant HTT (huntingtin) impairs mitophagy in a cellular model of Huntington disease. Autophagy. 17 (3), 672-689 (2021).
- Wang, Y., Guo, X., Ye, K., Orth, M., Gu, Z. Accelerated expansion of pathogenic mitochondrial DNA heteroplasmies in Huntington’s disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (30), 2014610118 (2021).
- Sajic, M., et al. Mitochondrial damage and ‘plugging’ of transport selectively in myelinated, small-diameter axons are major early events in peripheral neuroinflammation. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 61 (2018).
- Muke, I., et al. Ultrastructural characterization of mitochondrial damage in experimental autoimmune neuritis. Journal of Neuroinflammation. 343, 577218 (2020).
- Rodella, U., et al. An animal model of Miller Fisher Syndrome: mitochondrial hydrogen peroxide is produced by the autoimmune attack of nerve terminals and activates Schwann cells. Neurobiology of Disease. 96, 95-104 (2016).
- Han, M. M., Frizzi, K. E., Ellis, R. J., Calcutt, N. A., Fields, J. A. Prevention of HIV-1 TAT protein-induced Ppripheral neuropathy and mitochondrial disruption by the antimuscarinic pirenzepine. Frontiers in Neurology. 12, 663373 (2021).
- Roda, R. H., Hoke, A. Mitochondrial dysfunction in HIV-induced peripheral neuropathy. International Review of Neurobiology. 145, (2019).
- Palavicini, J. P., et al. Early disruption of nerve mitochondrial and myelin lipid homeostasis in obesity-induced diabetes. JCI Insight. 5 (21), 137286 (2020).
- Zheng, H., Xiao, W. H., Bennett, G. J. Functional deficits in peripheral nerve mitochondria in rats with paclitaxel- and oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Experimental Neurology. 232 (2), 154-161 (2011).
- Lim, T. K. Y., Rone, M. B., Lee, S., Antel, J. P., Zhang, J. Mitochondrial and bioenergetic dysfunction in trauma-induced painful peripheral neuropathy. Molecular Pain. 11, 58 (2015).
- Pesta, D., Gnaiger, E. High-resolution respirometry: OXPHOS protocols for human cells and permeabilized fibers from small biopsies of human muscle. Mitochondrial Bioenergetics: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology. 810, 25-58 (2012).
- Komlódi, T., et al. Comparison of mitochondrial incubation media for measurement of respiration and hydrogen peroxide production. Methods in Molecular Biology. 1782, 137-155 (2018).
- Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. III. The steady state. Journal of Biological Chemistry. 217 (1), 409-427 (1955).
- Korshunov, S. S., Skulachev, V. P., Starkov, A. A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Letters. 416 (1), 15-18 (1997).
- Gnaiger, E. Mitochondr Physiol Network. Mitochondrial Pathways and Respiratory Control. An Introduction to OXPHOS Analysis. 4th ed. , 80 (2014).
- Kuznetsov, A. V., et al. Mitochondrial defects and heterogeneous cytochrome c release after cardiac cold ischemia and reperfusion. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 286 (5), 1633-1641 (2004).
- Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967 (2016).
- Boveris, A., Chance, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide. General properties and effect of hyperbaric oxygen. Biochemical Journal. 134 (3), 707-716 (1973).
- Skulachev, V. P. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Reports. 17 (3), 347-366 (1997).
- Majava, V., et al. Structural and functional characterization of human peripheral nervous system myelin protein P2. PLoS One. 5, 10300 (2010).
- Greenfield, S., Brostoff, S., Eylar, E. H., Morell, P. Protein composition of myelin of the peripheral nervous system. Journal of Neurochemistry. 20 (4), 1207-1216 (1973).
- Kuznetsov, A. V., et al. Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells. Nature Protocols. 3, 965-976 (2008).
- Saks, V. A., et al. Permeabilized cell and skinned fiber techniques in studies of mitochondrial function in vivo. Molecular and Cellular Biochemistry. 184 (1-2), 81-100 (1998).
- Gnaiger, E. Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).
- Porter, C., et al. Mitochondrial respiratory capacity and coupling control decline with age in human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 309 (3), 224-232 (2015).
- Martins, E. L., et al. Rapid regulation of substrate use for oxidative phosphorylation during a single session of high intensity interval or aerobic exercises in different rat skeletal muscles. Comparative Biochemistry and Physiology B. 217, 40-50 (2018).
- Areti, A., Komirishetty, P., Kumar, A. Carvedilol prevents functional deficits in peripheral nerve mitochondria of rats with oxaliplatin-evoked painful peripheral neuropathy. Toxicology and Applied Pharmacology. 322, 97-103 (2017).
- Cooper, M. A., et al. Reduced mitochondrial reactive oxygen species production in peripheral nerves of mice fed a ketogenic diet. Experimental Physiology. 103 (9), 1206-1212 (2018).
- Jia, M., et al. Activation of NLRP3 inflammasome in peripheral nerve contributes to paclitaxel-induced neuropathic pain. Molecular Pain. 13, 1744806917719804 (2017).
- Muller, F. L., et al. Denervation-induced skeletal muscle atrophy is associated with increased mitochondrial ROS production. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 293 (3), 1159-1168 (2007).
