Respirometri med høj opløsning koblet til fluorescenssensorer bestemmer mitokondrie iltforbrug og reaktive iltarter (ROS) generation. Den nuværende protokol beskriver en teknik til at vurdere mitokondrie respiratoriske satser og ROS produktion i den permeabiliserede iskiasnerve.
Mitokondrie dysfunktion i perifere nerver ledsager flere sygdomme forbundet med perifer neuropati, som kan udløses af flere årsager, herunder autoimmune sygdomme, diabetes, infektioner, arvelige lidelser og tumorer. Vurdering af mitokondriefunktion i musens perifere nerver kan være udfordrende på grund af den lille prøvestørrelse, et begrænset antal mitokondrier, der er til stede i vævet, og tilstedeværelsen af en myelinskede. Teknikken beskrevet i dette arbejde minimerer disse udfordringer ved at bruge en unik permeabiliseringsprotokol tilpasset fra en, der anvendes til muskelfibre, til at vurdere iskiasnervens mitokondriefunktion i stedet for at isolere mitokondrierne fra vævet. Ved at måle fluorimetrisk reaktiv artsproduktion med Amplex Red/Peroxidase og sammenligne forskellige mitokondrie substrater og inhibitorer i saponinpermeabiliserede nerver var det muligt at detektere mitokondrie respiratoriske tilstande, reaktive iltarter (ROS) og aktiviteten af mitokondriekomplekser samtidigt. Derfor giver metoden, der præsenteres her, fordele i forhold til vurderingen af mitokondriefunktionen ved andre teknikker.
Mitokondrier er afgørende for at opretholde celle levedygtighed og udføre talrige cellefunktioner såsom energimetabolisme (glukose, aminosyre, lipid og nukleotid metabolisme veje). Som det primære sted for produktion af reaktive iltarter (ROS) er mitokondrier centrale i flere cellesignaleringsprocesser såsom apoptose og deltager i syntesen af jern-svovl (Fe-S) klynger, mitokondrieproteinimport og modning og vedligeholdelse af deres genom og ribosomer 1,2,3. Mitokondriemembrandynamiknetværket styres af fusions- og fissionsprocesser, og de har også maskiner til kvalitetskontrol ogmitofagi 4,5,6.
Mitokondrie dysfunktion er forbundet med udseendet af flere patologiske tilstande såsom kræft, diabetes og fedme7. Forstyrrelser i mitokondriefunktionen påvises i neurodegenerative lidelser, der påvirker centralnervesystemet, som i Alzheimers sygdom 8,9, Parkinsons sygdom10,11, amyotrofisk lateral sklerose12,13 og Huntingtons sygdom14,15 . I det perifere nervesystem observeres tab af mitokondriefunktion i axoner i immunneuropatier, såsom Guillain-Barré syndrom16,17, og i forbindelse med høj mitokondrie ROS-produktion i axoner fører disse begivenheder til MAP Kinase-aktivering i Schwann-celler18. Dette viser, at mitokondriefysiologi kan være afgørende ikke kun for en stedsspecifik celle, men for et helt væv. I HIV-associeret distal sensorisk polyneuropati (HIV-DSP) har mitokondrier en rolle i den mekanisme, hvormed transaktivatoren af transkriptionsprotein (HIV-TAT) tillader HIV at replikere effektivt, såvel som flere andre roller i HIV-infektionspatogenese19,20.
Evaluering af iskiasnerven mitokondrie fysiologi har vist sig som et væsentligt mål for undersøgelse af neuropati 7,21,22. I diabetisk neuropati tyder proteomiske og metabolomiske analyser på, at de fleste molekylære ændringer i diabetes påvirker iskiasnerven mitokondriel oxidativ phosphorylering og lipidmetabolisme7. Disse ændringer synes også at være tidlige tegn på fedme-induceret diabetes21. I en musemodel af kemoterapi-induceret smertefuld neuropati detekteres mitokondrieforringelse i iskiasnerven som et fald i oxidativ phosphorylering22 og en reduktion af mitokondriekomplekser aktiviteter, membranpotentiale og ATP-indhold23. Selvom flere grupper har citeret mitokondrie dysfunktion i neuropatier, er disse undersøgelser begrænset til målinger af aktivitet i mitokondriekomplekser uden bevarelse af mitokondriemembranerne, manglende evaluering af mitokondrieintegritet eller målinger af ATP-indhold som parameter for mitokondrie-ATP-produktion. Generelt kræver en korrekt vurdering af mitokondrie iltforbrug og ROS-produktion isolering af mitokondrier ved differentiel centrifugering i en percoll / saccharosegradient. Isolering af mitokondrier kan også være en begrænsende faktor for iskiasnervevæv på grund af den store mængde væv, der er nødvendig, og mitokondrier tab og forstyrrelse.
Denne undersøgelse har til formål at tilvejebringe en protokol til måling af mitokondriefysiologi som mitokondrie iltforbrug og ROS-produktion i iskiasnerven, bevare mitokondriemembraner og uden behov for isolering af mitokondrier. Denne protokol er tilpasset fra iltforbrugsmålinger i permeabiliserede muskelfibre24 ved respirometri med høj opløsning (HRR). Fordelene ved denne procedure er muligheden for at evaluere mitokondrier i små mængder væv såsom iskiasnerven og evaluere mitokondrieparametre in situ og derved bevare mitokondriemiljøet, strukturen og den bioenergetiske profil for at opnå et fysiologisk pålideligt resultat. De mitokondrielle respiratoriske tilstande blev bestemt med substrater og hæmmere efter iskiasnervepermeabilitet for korrekt at vurdere mitokondriebioenergetik og cytokrom c-koefficient for mitokondriemembranintegritet, hvilket giver en vejledning til trin i mitokondrieelektrontransportsystemet (ETS) evaluering og beregning af væsentlige parametre. Denne undersøgelse kan give værktøjer til at besvare spørgsmål i patofysiologiske mekanismer, hvor iskiasnervenmetabolisme er impliceret, såsom perifere neuropatier.
Flere sygdomme eller tilstande, der ledsager neuropatier, har mitokondrie dysfunktion som en risikofaktor. Evalueringen af mitokondriefunktionen i perifere nerver er afgørende for at belyse, hvordan mitokondrierne virker i disse neurodegenerative tilstande. Vurderingen af mitokondriefunktionen er besværlig på grund af vanskeligheden ved isolationsmetoden og manglen på materiale. Således er udviklingen af vævspermeabiliseringsteknikker, der ikke kræver isolering af mitokondrier, afgørende.
<p class="jove_conte…The authors have nothing to disclose.
Denne undersøgelse blev finansieret af Instituto Serrapilheira, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior-Brasil (CAPES). Vi er taknemmelige for Dr. Antonio Galina Filho, Dr. Monica Montero Lomeli og Dr. Claudio Masuda for støtten med laboratoriefaciliteter og Dr. Martha Sorenson for venlige og værdifulde kommentarer til forbedring af artiklen.
Adenosine 5' triphosphate dissodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt | Sigma-Aldrich | A2754 | |
Amplex Red Reagent | Thermo Fisher scientific | A12222 | Amplex Red is prepared in DMSO accordindly with product datasheet |
Antimycin A (from Streptomyces sp.) | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030 | heat shock fraction, protease free, fatty acid free, essentially globulin free, pH 7, ≥98% |
Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C6763 | |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Sigma-Aldrich | C2920 | |
Cytochrome c | Sigma-Aldrich | C7752 | (from equine heart; small hemeprotein) |
DataLab version 5.1.1.91 | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | Copyright (c) 2002 – 13 by Dr. Erich Gnaiger | |
Digital orbital microplate shaker 120V | Thermo Fisher scientific | 88882005 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43819 | |
EGTA sodium salt | Sigma-Aldrich | E8145 | |
Hamilton syringe | Sigma-Aldrich | HAM80075 | 10 uL, 25 uL and 50 uL |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hydrogen peroxide solution 30% W/W | Merck | H1009 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
L-(−)-Malic acid | Sigma-Aldrich | M7397 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2393 | |
MES sodium salt | Sigma-Aldrich | M3885 | |
Micro-dissecting forceps, curved | Sigma-Aldrich | F4142 | |
Micro-dissecting forceps, straight | Sigma-Aldrich | F4017 | |
O2K – Filter set Amplex Red | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44321-01 | Fasching M, Sumbalova Z, Gnaiger E (2013) O2k-Fluorometry: HRR and H2O2 production in mouse brain mitochondria. Mitochondr Physiol Network 17.17. |
O2K – Fluorescence LED2 – module component Fluorscence-Sensor Green | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | 44210-01 | |
Oligomycin | Sigma-Aldrich | O4876 | (from Streptomyces diastatochromogenes; mixture of oligomycins A, B, and C |
OROBOROS Oxygraph-2k | OROBOROS INSTRUMENTS, Austria | http://www.oroboros.at | |
Palmitoylcarnitine (Palmitoyl-DL-carnitine-HCl) | Sigma-Aldrich | P4509 | |
Peroxidase from horseradish | Sigma-Aldrich | P8375 | |
Petri dishes, polystyrene | MERCK | P5606 | |
Phosphocreatine disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | P7936 | |
Potassium dihydrogen phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | PHR1330 | |
Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221473 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Saponin | Sigma-Aldrich | SAE0073 | |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | |
Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma-Aldrich | S2378 | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S9378 | |
Taurine | Sigma-Aldrich | T0625 |