بروتوكول لتطوير نموذج قطع عظم الفخذ في فئران ويستار ألبينو
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا لكسر عمود عظم الفخذ من فئران Wistar albino ومتابعة تطور الكالس. يمكن أن يساعد نموذج قطع عظم الفخذ هذا الباحثين في تقييم عملية التئام الكسور ودراسة كيفية تأثير الدواء على التئام الكسور.
Abstract
التئام الكسور هو عملية فسيولوجية تؤدي إلى تجديد عيوب العظام من خلال العمل المنسق لبانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم. الأدوية الابتنائية العظمية لديها القدرة على زيادة إصلاح الكسور ولكن لها قيود مثل التكاليف المرتفعة أو الآثار الجانبية غير المرغوب فيها. يمكن تحديد إمكانات شفاء العظام للدواء في البداية من خلال الدراسات المختبرية ، ولكن هناك حاجة إلى دراسات في الجسم الحي للإثبات النهائي للمفهوم. كان هدفنا هو تطوير نموذج للقوارض العظمية لعظم الفخذ يمكن أن يساعد الباحثين على فهم تطور تكوين الكالس بعد كسر عمود عظم الفخذ ويمكن أن يساعد في تحديد ما إذا كان الدواء المحتمل له خصائص شفاء العظام. تم استخدام ذكور الفئران البيضاء Wistar albino البالغة بعد تصريح لجنة أخلاقيات الحيوان المؤسسية. تم تخدير القوارض ، وفي ظل ظروف معقمة ، تم إنشاء كسور عرضية كاملة في الثلث الأوسط من مهاوي عظم الفخذ باستخدام قطع العظم المفتوح. تم تقليل الكسور وإصلاحها داخليا باستخدام أسلاك K داخل النخاع ، وسمح بحدوث التئام الكسور الثانوية. بعد الجراحة ، تم إعطاء المسكنات داخل الصفاق والمضادات الحيوية لمدة 5 أيام. الأشعة السينية الأسبوعية المتسلسلة تقييم تشكيل الكالس. تم التضحية بالفئران بناء على نقاط زمنية محددة إشعاعيا مسبقا ، وتم تحليل تطور الكالس المكسور إشعاعيا وباستخدام الكيمياء المناعية.
Introduction
العظم هو نسيج ضام كثيف يتكون من الخلايا المكونة للعظام ، وبانيات العظم ، والخلايا الممتصة للعظام ، ناقضات العظم. التئام الكسور هو عملية فسيولوجية تؤدي إلى تجديد عيوب العظام من خلال العمل المنسق لبانيات العظم والخلايا الآكلة للعظم1. عندما يكون هناك كسر ، فإن نشاط العظم العظمي والعظم العظمي في موقع الكسر هي بعض العوامل المهمة التي تحدد شفاء العظام2. عندما ينحرف التئام الكسر عن مساره الطبيعي ، فإنه يؤدي إلى تأخر الاتحاد أو سوء الاتحاد أو عدم الاتحاد. يقال إن الكسر يكون في حالة عدم الاتحاد عندما يكون هناك فشل في اتحاد الكسر لمدة 9 أشهر ، مع عدم وجود تقدم في الإصلاح في آخر 3 أشهر3. ما يقرب من 10٪ -15٪ من جميع الكسور تعاني من تأخير في الإصلاح قد يتطور إلى nonunion4. معدل عدم الاتحاد لجميع الكسور هو 5٪ -10٪ ويختلف باختلاف العظم المعني وموقع الكسر5.
يشتمل النظام الحالي لعلاج عدم اتحاد الكسور على طرائق جراحية و / أو طبية. في الوقت الحالي ، يمكن التغلب على الكسور المتأخرة أو غير المنتظمة عن طريق الاستراتيجيات الجراحية مثل تطعيم العظام. ومع ذلك ، فإن تطعيم العظام له حدوده ومضاعفاته مثل توافر أنسجة الكسب غير المشروع ، وألم موقع المتبرع ، والمراضة ، والعدوى6. يشمل العلاج الطبي أدوية الابتنائية العظمية مثل البروتين المورفولوجي العظمي (BMP) وتيريباراتيد (نظير هرمون البارات). عوامل الابتنائية العظمية المستخدمة حاليا لديها القدرة على زيادة إصلاح الكسور ولكن لها قيود مثل التكاليف الباهظة أو الآثار الجانبية غير المرغوب فيها7. وبالتالي ، هناك مجال لتحديد بدائل غير جراحية فعالة من حيث التكلفة لشفاء العظام. يمكن تحديد إمكانات شفاء العظام للدواء في البداية من خلال الدراسات المختبرية ، ولكن هناك حاجة إلى دراسات في الجسم الحي للإثبات النهائي للمفهوم. يجب تقييم الدواء المعروف بتعزيز التئام العظام في المختبر ، وإذا وجد واعدا ، يمكن استخدامه في دراسات النماذج الحيوانية في الجسم الحي . إذا أثبت الدواء أنه يعزز تكوين العظام وإعادة تشكيلها في النموذج الحي ، فيمكن أن ينتقل إلى المرحلة التالية (أي التجارب السريرية).
يعد تقييم التئام الكسور في الحيوانات خطوة منطقية إلى الأمام لتقييم عامل جديد تم تقديمه لشفاء العظام قبل أن يخضع لتجارب بشرية. بالنسبة لدراسات النموذج الحيواني في الجسم الحي لالتئام الكسور ، أصبحت القوارض نموذجاشائعا بشكل متزايد 8. ولدت نماذج القوارض اهتماما متزايدا بسبب انخفاض تكاليف التشغيل ، والحاجة المحدودة للمساحة ، والوقت الأقل اللازم لشفاء العظام9. بالإضافة إلى ذلك ، تحتوي القوارض على مجموعة واسعة من الأجسام المضادة والأهداف الجينية ، والتي تسمح بإجراء دراسات على الآليات الجزيئية لشفاء العظام وتجديدها10. سلط اجتماع توافقي الضوء بشكل شامل على العديد من نماذج شفاء عظام الحيوانات الصغيرة وركز على المعلمات المختلفة التي تؤثر على شفاء العظام ، بالإضافة إلى التأكيد على العديد من نماذج كسور الحيوانات الصغيرة والغرسات11.
يمكن تقسيم نماذج الكسر الأساسية على نطاق واسع إلى نماذج مفتوحة أو مغلقة. تستخدم نماذج الكسور المغلقة قوة ثني من ثلاث أو أربع نقاط على العظم ولا تتطلب نهجا جراحيا تقليديا. أنها تؤدي إلى كسور مائلة أو حلزونية ، تشبه كسور العظام الطويلة في البشر ، ولكن عدم توحيد موقع الكسر وأبعاده قد يكون بمثابة عامل مربك فيها12. تتطلب نماذج الكسور المفتوحة الوصول الجراحي لقطع العظم العظمي ، وتساعد على تحقيق نمط كسر أكثر اتساقا في موقع الكسر ، ولكنها ترتبط بتأخر الشفاء مقارنة بالنماذج المغلقة13. يبقى اختيار العظام المستخدمة لدراسة التئام الكسور بشكل أساسي الساق وعظم الفخذ نظرا لأبعادهما وإمكانية الوصول إليهما. عادة ما يكون اختيار موقع الكسر هو الحجاب الحاجز أو الميتافيزيس. يتم اختيار منطقة metaphyseal خصيصا في الحالات التي يتم فيها دراسة التئام الكسور في مواضيع هشاشة العظام ، حيث أن metaphysis أكثر تأثرا بهشاشة العظام14. يمكن استخدام العديد من الغرسات مثل المسامير داخل النخاع والمثبتات الخارجية لتثبيت الكسر11,15.
كان الهدف من هذه الدراسة هو تطوير نموذج بسيط وسهل المتابعة للقوارض يمكن أن يساعد الباحثين ليس فقط على فهم تطور الكالس بعد كسر عظم الفخذ ولكن يمكن أن يساعد في تحديد ما إذا كان الدواء المحتمل له خصائص شفاء العظام من خلال فهم الآلية التي يعمل بها.
Protocol
Representative Results
Discussion
تصف هذه الطريقة بوضوح التفاصيل اللازمة لتطوير نموذج قطع العظم للكسر في فئران Wistar albino. يمكن استخدام هذا النموذج لتقييم التأثير العظمي لدواء ابتنائية عظمي واعد في التئام الكسور ، وكذلك فهم تعقيدات التئام العظام. الميزة البارزة لهذه الطريقة هي أنها بسيطة ولا تحتاج إلى الكثير من الوقت أو الم?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا المجلس المركزي للبحوث في المعالجة المثلية (CCRH) ، وزارة AYUSH ، حكومة الهند ، على تمويل البحوث. يعرب المؤلفون عن امتنانهم لمساعدة ودعم مرفق الحيوان المركزي ، AIIMS ، نيودلهي ، لمساعدتهم ودعمهم في التجارب على الحيوانات و CMET ، AIIMS ، نيودلهي ، لمساعدتهم ودعمهم في التصوير الفوتوغرافي والفيديو.
Materials
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
Riferimenti
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W. Assessment of compromised fracture healing. JAAOS – Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 20 (5), 273-282 (2012).
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -. M., Sioud, M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. , (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
