Protocole pour le développement d’un modèle d’ostéotomie fémure chez le rat albinos Wistar

Summary

Ici, nous présentons un protocole pour fracturer iatrogène la tige du fémur des rats albinos Wistar et suivre le développement du callus. Ce modèle d’ostéotomie du fémur peut aider les chercheurs à évaluer le processus de guérison des fractures et à étudier comment un médicament pourrait influencer la guérison des fractures.

Abstract

La cicatrisation des fractures est un processus physiologique entraînant la régénération des défauts osseux par l’action coordonnée des ostéoblastes et des ostéoclastes. Les médicaments ostéoanabolisants ont le potentiel d’augmenter la réparation des fractures, mais ont des contraintes telles que des coûts élevés ou des effets secondaires indésirables. Le potentiel de guérison osseuse d’un médicament peut initialement être déterminé par des études in vitro , mais des études in vivo sont nécessaires pour la preuve de concept finale. Notre objectif était de développer un modèle d’ostéotomie du fémur chez les rongeurs qui pourrait aider les chercheurs à comprendre le développement de la formation de cals à la suite d’une fracture de la tige du fémur et qui pourrait aider à établir si un médicament potentiel a des propriétés de guérison osseuse. Des rats adultes Wistar albinos mâles ont été utilisés après l’autorisation du Comité d’éthique animale de l’établissement. Les rongeurs ont été anesthésiés et, dans des conditions aseptiques, des fractures transversales complètes au milieu du tiers des tiges des fémurs ont été créées par ostéotomie ouverte. Les fractures ont été réduites et fixées à l’intérieur à l’aide de fils K intramédullaires, et la cicatrisation secondaire des fractures a été autorisée. Après la chirurgie, des analgésiques intrapéritonéaux et des antibiotiques ont été administrés pendant 5 jours. Des radiographies hebdomadaires séquentielles ont évalué la formation de callosités. Les rats ont été sacrifiés en fonction de points temporels radiologiquement prédéterminés, et le développement du cal de fracture a été analysé radiologiquement et en utilisant l’immunohistochimie.

Introduction

L’os est un tissu conjonctif dense composé de cellules formant des os, les ostéoblastes, et de cellules résorbant les os, les ostéoclastes. La cicatrisation des fractures est un processus physiologique aboutissant à la régénération des défauts osseux par l’action coordonnée des ostéoblastes et des ostéoclastes¹. Lorsqu’il y a une fracture, l’activité ostéoblastique et ostéoclastique au site de la fracture sont quelques-uns des facteurs importants qui déterminent la guérison osseuse². Lorsque la guérison des fractures s’écarte de son cours normal, il en résulte une union retardée, une malunion ou une non-union. Une fracture est dite non consolidée lorsqu’il y a une rupture de consolidation de la fracture pendant 9 mois, sans progression de réparation au cours des 3 derniers mois³. Environ 10 % à 15 % de toutes les fractures subissent un retard de réparation qui peut évoluer vers la non-union⁴. Le taux de non-union pour toutes les fractures est de 5% à 10% et varie en fonction de l’os impliqué et du site de fracture⁵.

Le schéma thérapeutique actuel pour le traitement de la non-union des fractures comprend des modalités chirurgicales et/ou médicales. Actuellement, les fractures retardées ou non liées peuvent être surmontées par des stratégies chirurgicales telles que la greffe osseuse. Cependant, la greffe osseuse a ses limites et ses complications comme la disponibilité du tissu du greffon, la douleur au site donneur, la morbidité et l’infection⁶. Le traitement médical comprend des médicaments ostéoanabolisants comme la protéine morphogénétique osseuse (BMP) et le tériparatide (analogue de la parathormone). Les agents ostéoanabolisants actuellement utilisés ont le potentiel d’augmenter la réparation des fractures, mais ont des contraintes telles que des coûts exorbitants ou des effets secondaires indésirables⁷. Par conséquent, il est possible d’identifier des alternatives rentables et non chirurgicales pour la guérison osseuse. Le potentiel de guérison osseuse d’un médicament peut initialement être déterminé par des études in vitro , mais des études in vivo sont nécessaires pour la preuve de concept finale. Un médicament connu pour améliorer la guérison osseuse doit être évalué in vitro et, s’il s’avère prometteur, peut être utilisé pour des études in vivo sur des modèles animaux. Si le médicament s’avère favoriser la formation et le remodelage osseux dans le modèle in vivo , il pourrait passer à l’étape suivante (c.-à-d. essais cliniques).

L’évaluation de la guérison des fractures chez les animaux est une étape logique pour évaluer un nouvel agent introduit pour la guérison osseuse avant qu’il ne subisse des essais sur l’homme. Pour les études in vivo sur modèle animal de la guérison des fractures, les rongeurs sont devenus un modèle⁸ de plus en plus populaire. Les modèles de rongeurs ont suscité un intérêt croissant en raison des faibles coûts opérationnels, du besoin limité d’espace et de moins de temps nécessaire à la guérison osseuse⁹. De plus, les rongeurs disposent d’un large spectre d’anticorps et de cibles génétiques, ce qui permet d’étudier les mécanismes moléculaires de la cicatrisation et de la régénération^{osseuses 10}. Une réunion de consensus a mis en évidence de manière exhaustive divers modèles de guérison osseuse de petits animaux et s’est concentrée sur les différents paramètres influençant la guérison osseuse, ainsi que sur plusieurs modèles de fractures et d’implants de petits animaux¹¹.

Les modèles de fracture de base peuvent être largement divisés en modèles ouverts ou fermés. Les modèles de fracture fermée utilisent une force de flexion à trois ou quatre points sur l’os et ne nécessitent pas d’approche chirurgicale conventionnelle. Ils conduisent à des fractures obliques ou en spirale, ressemblant à des fractures des os longs chez l’homme, mais le manque de normalisation de l’emplacement et des dimensions des fractures peut agir comme un facteur de confusion en eux¹². Les modèles de fracture ouverte nécessitent un accès chirurgical pour l’ostéotomie de l’os, aident à obtenir un schéma de fracture plus cohérent au site de la fracture, mais sont associés à une cicatrisation retardée par rapport aux modèles fermés¹³. Le choix de l’os utilisé pour étudier la cicatrisation des fractures reste principalement le tibia et le fémur en raison de leurs dimensions et de leur accessibilité. Le choix du site de fracture est généralement la diaphyse ou la métaphyse. La région métaphysaire est spécialement choisie dans les cas où la cicatrisation des fractures est étudiée chez les sujets ostéoporotiques, car la métaphyse est plus affectée par l’ostéoporose¹⁴. Plusieurs implants comme les broches intramédullaires et les fixateurs externes peuvent être utilisés pour stabiliser la fracture^11,15.

L’objectif de cette étude était de développer un modèle de rongeur simple et facile à suivre qui pourrait aider les chercheurs non seulement à comprendre le développement du cal après une fracture du fémur, mais pourrait aider à déterminer si un médicament potentiel a des propriétés de guérison osseuse en comprenant le mécanisme par lequel il agit.

Protocol

Les expériences sur les animaux ont été réalisées après avoir obtenu l’approbation éthique du Comité institutionnel d’éthique animale (IAEC), AIIMS, New Delhi, Inde (286/IAF-1/2021). 1. Procédure préopératoire Hébergez des rats albinos Wistar mâles âgés de 6 à 8 semaines, pesant entre 150 et 200 g chacun, dans une animalerie centrale (CAF) dans des cages individuelles séparées. Cela garantit qu’il n’y a pas de blessure chirurgicale ou au si…

Representative Results

Cette étude a été entreprise pour développer un modèle d’ostéotomie du fémur chez des rats albinos Wistar. Ce modèle peut être utilisé pour évaluer la guérison osseuse, ainsi que l’effet ostéogénique d’un médicament ostéoanabolisant prometteur dans la guérison osseuse. Les précautions et protocoles chirurgicaux standard ont été suivis. Des blouses stériles, des champs et du matériel chirurgical ont été utilisés pour l’intervention (figure 1). L’équipement …

Discussion

Cette méthode décrit avec lucidité les détails nécessaires pour développer un modèle d’ostéotomie de fracture chez les rats albinos Wistar. Ce modèle peut être utilisé pour évaluer l’effet ostéogénique d’un médicament ostéoanabolisant prometteur dans la guérison des fractures, ainsi que pour comprendre les subtilités de la guérison osseuse. La caractéristique principale de cette méthode est qu’elle est simple et ne nécessite pas trop de temps ou d’équipement sophistiqué. Dans cette méth…

Materials

Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2