פרוטוקול לפיתוח מודל אוסטאוטומיה של עצם הירך בחולדות ויסטאר אלבינו
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשבר יאטרוגני של פיר עצם הירך של חולדות לבקנים Wistar ומעקב אחר התפתחות היבלת. מודל זה של אוסטאוטומיה של עצם הירך יכול לסייע לחוקרים להעריך את תהליך ריפוי השבר ולחקור כיצד תרופה יכולה להשפיע על ריפוי שברים.
Abstract
ריפוי שברים הוא תהליך פיזיולוגי המביא להתחדשות פגמים בעצמות על ידי פעולה מתואמת של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים. לתרופות אוסטאואנבוליות יש פוטנציאל להגביר את תיקון השברים, אך יש להן אילוצים כמו עלויות גבוהות או תופעות לוואי לא רצויות. פוטנציאל ריפוי העצם של תרופה יכול להיקבע בתחילה על ידי מחקרים במבחנה , אך מחקרי in vivo נדרשים להוכחת ההיתכנות הסופית. מטרתנו הייתה לפתח מודל מכרסם אוסטאוטומיה של עצם הירך שיוכל לסייע לחוקרים להבין את התפתחות היווצרות היבלות בעקבות שבר בפיר עצם הירך, ושיוכל לעזור לקבוע אם לתרופה פוטנציאלית יש תכונות ריפוי עצם. חולדות לבקנים זכרים בוגרים של Wistar שימשו לאחר אישור ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים. המכרסמים הורדמו, ובתנאים אספטיים נוצרו שברים רוחביים שלמים בשליש האמצעי של פירי עצם הירך באמצעות אוסטאוטומיה פתוחה. השברים צומצמו וקובעו פנימית באמצעות חוטי K תוך-מדולריים, וריפוי שברים משני הותר להתרחש. לאחר הניתוח, משככי כאבים intraperitoneal ואנטיביוטיקה ניתנו במשך 5 ימים. צילומי רנטגן שבועיים רציפים העריכו היווצרות יבלות. החולדות הוקרבו על סמך נקודות זמן רדיולוגיות שנקבעו מראש, והתפתחות יבלת השבר נותחה באופן רדיולוגי ובאמצעות אימונוהיסטוכימיה.
Introduction
עצם היא רקמת חיבור צפופה המורכבת מתאים יוצרי עצם, אוסטאובלסטים, ותאים סופגי עצמות, האוסטאוקלסטים. ריפוי שברים הוא תהליך פיזיולוגי המביא להתחדשות פגמים בעצמות על ידי פעולה מתואמת של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים1. כאשר יש שבר, פעילות אוסטאובלסטית ואוסטאוקלסטית באתר השבר הם חלק מהגורמים החשובים הקובעים את ריפוי העצם2. כאשר ריפוי שברים חורג ממסלולו הרגיל, הוא גורם לעיכוב באיחוד, אי-איחוד או אי-איחוד. שבר אמור להיות ב- nonunion כאשר יש כשל של איחוד של השבר במשך 9 חודשים, ללא התקדמות של תיקון ב 3 החודשים האחרונים3. כ-10%-15% מכלל השברים חווים עיכוב בתיקון שעלול להתקדםל-nonunion 4. שיעור אי-האיחוד של כל השברים הוא 5%-10% ומשתנה בהתאם לעצם המעורבת ולאתר השבר5.
המשטר הנוכחי לטיפול בשברים כולל שיטות כירורגיות ו/או רפואיות. נכון לעכשיו, עיכוב או nonunion של שברים ניתן להתגבר על ידי אסטרטגיות כירורגיות כמו השתלת עצם. עם זאת, להשתלת עצם יש מגבלות וסיבוכים כמו זמינות של רקמת השתל, כאבים באתר התורם, תחלואה וזיהום6. הטיפול הרפואי כולל תרופות אוסטאואנאבוליות כמו חלבון מורפוגנטי של העצם (BMP) וטריפראטיד (אנלוגי פאראטמונרלי). לחומרים אוסטאואנבוליים הנמצאים בשימוש כיום יש פוטנציאל להגביר את תיקון השברים אך יש להם אילוצים כמו עלויות מופקעות או תופעות לוואי לא רצויות7. לפיכך, יש מקום לזיהוי חלופות חסכוניות ולא כירורגיות לריפוי עצם. פוטנציאל ריפוי העצם של תרופה יכול להיקבע בתחילה על ידי מחקרים במבחנה , אך מחקרי in vivo נדרשים להוכחת ההיתכנות הסופית. תרופה הידועה כמשפרת את ריפוי העצם צריכה לעבור הערכה במבחנה , ואם היא נמצאת מבטיחה, ניתן להשתמש בה למחקרי מודל של חיות in vivo . אם התרופה תוכיח שהיא מקדמת היווצרות עצם ושיפוץ מחדש במודל in vivo , היא תוכל להמשיך לשלב הבא (כלומר, ניסויים קליניים).
הערכת ריפוי שברים בבעלי חיים היא צעד הגיוני קדימה כדי להעריך סוכן חדש שהוכנס לריפוי עצם לפני שהוא עובר ניסויים בבני אדם. עבור מחקרי מודל בעלי חיים in vivo של ריפוי שברים, מכרסמים הפכו למודל8 פופולרי יותר ויותר. דגמי המכרסמים עוררו עניין הולך וגובר בשל עלויות התפעול הנמוכות, הצורך המוגבל במקום ופחות זמן הדרוש לריפוי עצם9. בנוסף, למכרסמים יש ספקטרום רחב של נוגדנים ומטרות גנטיות, המאפשרים מחקרים על המנגנונים המולקולריים של ריפוי והתחדשות עצם10. ישיבת קונצנזוס הדגישה באופן מקיף מודלים שונים לריפוי עצמות של בעלי חיים קטנים והתמקדה בפרמטרים השונים המשפיעים על ריפוי העצם, כמו גם בדגש על מספר מודלים של שברים ושתלים של בעלי חיים קטנים11.
ניתן לחלק את מודלי השבר הבסיסיים באופן רחב למודלים פתוחים או סגורים. מודלים של שבר סגור משתמשים בכוח כיפוף של שלוש או ארבע נקודות על העצם ואינם דורשים גישה כירורגית קונבנציונלית. הם מובילים לשברים אלכסוניים או ספירליים, הדומים לשברים ארוכים בעצמות בבני אדם, אך היעדר סטנדרטיזציה של מיקום השבר ומממדיו עשוי לשמש גורם מבלבל בהם12. מודלים של שבר פתוח דורשים גישה כירורגית לאוסטאוטומיה של העצם, עוזרים להשיג דפוס שבר עקבי יותר באתר השבר, אך קשורים להחלמה מאוחרת בהשוואה למודלים הסגורים13. הבחירה בעצם המשמשת לחקר ריפוי שברים נותרה בעיקר השוקה ועצם הירך בשל מידותיהם ונגישותם. הבחירה של אתר השבר היא בדרך כלל diaphysis או metaphysis. האזור המטאפיזיאלי נבחר במיוחד במקרים בהם ריפוי שברים נלמד בנושאים אוסטאופורוטיים, שכן המטאפיזה מושפעת יותר מאוסטאופורוזיס14. ניתן להשתמש במספר שתלים כמו פינים תוך-מדולריים וקיבועים חיצוניים כדי לייצב את השבר11,15.
מטרת המחקר הייתה לפתח מודל מכרסמים פשוט וקל למעקב, שיוכל לסייע לחוקרים לא רק להבין את התפתחות היבלת בעקבות שבר בעצם הירך, אלא גם לסייע לקבוע אם לתרופה פוטנציאלית יש תכונות ריפוי עצם על ידי הבנת המנגנון שבאמצעותו היא פועלת.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו מתארת בבהירות את הפרטים הדרושים לפיתוח מודל אוסטאוטומיה של שבר בחולדות לבקנים של Wistar. מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעה האוסטאוגנית של תרופה אוסטאואנבולית מבטיחה בריפוי שברים, כמו גם להבין את המורכבות של ריפוי עצם. התכונה הבולטת של שיטה זו היא שהיא פשוטה ואינה זקוקה ליותר מדי …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות למועצה המרכזית למחקר בהומאופתיה (CCRH), משרד איו”ש, ממשלת הודו, על מימון המחקר. המחברים מודים על העזרה והתמיכה של מתקן החיות המרכזי, AIIMS, ניו דלהי, על עזרתם ותמיכתם בניסויים בבעלי חיים ו- CMET, AIIMS, ניו דלהי, על עזרתם ותמיכתם בצילום ווידאוגרפיה.
Materials
| Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
| Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
| Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
| Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
| Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
| EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
| Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
| Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
| Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
| Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
| Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
| Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
| Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
| Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
| Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
| Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
| K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
| Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
| Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
| Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
| Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
| Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
| Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
| Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
| Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
| Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
| Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
| Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
| Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
| Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
| Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
| Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
| Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
| Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
| Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
| Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
| Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
| X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |
Riferimenti
- Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
- Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
- Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W. Assessment of compromised fracture healing. JAAOS – Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 20 (5), 273-282 (2012).
- Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
- Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
- Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
- Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
- Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
- Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
- Houdebine, L. -. M., Sioud, M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. , (2007).
- Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
- Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
- Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
- Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
- Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
- Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
- Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
- Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
- Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
- Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
