Här presenterar vi ett protokoll för att iatrogent bryta axeln på lårbenet hos Wistar albino råttor och följa upp utvecklingen av callus. Denna osteotomimodell för lårben kan hjälpa forskare att utvärdera processen för frakturläkning och att studera hur ett läkemedel kan påverka frakturläkning.
Frakturläkning är en fysiologisk process som resulterar i regenerering av bendefekter genom samordnad verkan av osteoblaster och osteoklaster. Osteoanabola läkemedel har potential att öka reparationen av frakturer men har begränsningar som höga kostnader eller oönskade biverkningar. Benläkningspotentialen hos ett läkemedel kan initialt bestämmas genom in vitro-studier , men in vivo-studier behövs för det slutliga beviset på konceptet. Vårt mål var att utveckla en lårben osteotomi gnagare modell som kan hjälpa forskare att förstå utvecklingen av kallusbildning efter fraktur av lårbenets axel och som kan hjälpa till att fastställa om ett potentiellt läkemedel har benläkande egenskaper. Vuxna manliga Wistar albino råttor användes efter godkännande av institutionella djurförsöksetiska kommittén. Gnagarna bedövades, och under aseptiska förhållanden skapades fullständiga tvärgående frakturer i mitten en tredjedel av lårbenens axlar med öppen osteotomi. Frakturerna reducerades och fixerades internt med hjälp av intramedullära K-trådar, och sekundär frakturläkning tilläts ske. Efter operationen gavs intraperitoneala analgetika och antibiotika i 5 dagar. Sekventiell röntgen varje vecka bedömde kallusbildning. Råttorna offrades baserat på radiologiskt förutbestämda tidpunkter, och utvecklingen av frakturkallusen analyserades radiologiskt och med hjälp av immunohistokemi.
Ben är en tät bindväv som består av benbildande celler, osteoblasterna och benresorberande celler, osteoklasterna. Frakturläkning är en fysiologisk process som resulterar i regenerering av bendefekter genom samordnad verkan av osteoblaster och osteoklaster1. När det finns en fraktur är osteoblastisk och osteoklastisk aktivitet vid frakturstället några av de viktiga faktorer som bestämmer benläkning2. När frakturläkning avviker från sin normala kurs resulterar det i en försenad union, malunion eller nonunion. En fraktur sägs vara i icke-förening när det finns ett misslyckande av förening av frakturen i 9 månader, utan någon utveckling av reparation under de senaste 3 månaderna3. Cirka 10%-15% av alla frakturer upplever en fördröjning i reparationen som kan utvecklas till nonunion4. Nonunionfrekvensen för alla frakturer är 5% -10% och varierar beroende på benet som är involverat och platsen för fraktur5.
Den nuvarande behandlingen för behandling av frakturförening omfattar kirurgiska och / eller medicinska metoder. För närvarande kan fördröjd eller icke-förening av frakturer övervinnas genom kirurgiska strategier som bentransplantation. Bentransplantation har dock sina begränsningar och komplikationer som tillgänglighet av transplantatvävnad, smärta vid donatorplatsen, sjuklighet och infektion6. Medicinsk behandling omfattar osteoanabola läkemedel som benmorfogenetiskt protein (BMP) och teriparatid (parathormonanalog). För närvarande används osteoanabola agenter har potential att öka reparationen av frakturer men har begränsningar som orimliga kostnader eller oönskade biverkningar7. Därför finns det utrymme för att identifiera kostnadseffektiva, icke-kirurgiska alternativ för benläkning. Benläkningspotentialen hos ett läkemedel kan initialt bestämmas genom in vitro-studier , men in vivo-studier behövs för det slutliga beviset på konceptet. Ett läkemedel som är känt för att förbättra benläkning bör utvärderas in vitro och, om det visar sig lovande, kan användas för in vivo djurmodellstudier. Om läkemedlet visar sig främja benbildning och ombyggnad i in vivo-modellen kan det gå vidare till nästa steg (dvs. kliniska prövningar).
Att bedöma frakturläkning hos djur är ett logiskt steg framåt för att utvärdera ett nytt medel som introducerats för benläkning innan det genomgår mänskliga försök. För in vivo djurmodellstudier av frakturläkning har gnagare blivit en allt populärare modell8. Gnagarmodellerna har genererat ökande intresse på grund av de låga driftskostnaderna, det begränsade behovet av utrymme och mindre tid som behövs för benläkning9. Dessutom har gnagare ett brett spektrum av antikroppar och genmål, vilket möjliggör studier av de molekylära mekanismerna för benläkning och regenerering10. Ett konsensusmöte belyste omfattande olika benläkningsmodeller för smådjur och fokuserade på de olika parametrar som påverkar benläkning, samt betonade flera smådjursfrakturmodeller och implantat11.
Grundläggande sprickmodeller kan i stort sett delas in i öppna eller slutna modeller. Slutna frakturmodeller använder en tre- eller fyrpunkts böjkraft på benet och kräver inte ett konventionellt kirurgiskt tillvägagångssätt. De leder till sneda eller spiralfrakturer, som liknar långa benfrakturer hos människor, men bristen på standardisering av frakturplats och dimensioner kan fungera som en förvirrande faktor i dem12. Öppna frakturmodeller kräver kirurgisk åtkomst för benets osteotomi, hjälper till att uppnå ett mer konsekvent frakturmönster vid frakturstället, men är förknippade med fördröjd läkning jämfört med de slutna modellerna13. Valet av ben som används för att studera frakturläkning förblir huvudsakligen tibia och lårben på grund av deras dimensioner och tillgänglighet. Valet av platsen för fraktur är vanligtvis diafys eller metafys. Den metafysala regionen är speciellt vald i fall där frakturläkning studeras hos osteoporotiska ämnen, eftersom metafysen påverkas mer av osteoporos14. Flera implantat som intramedullära stift och externa fixatorer kan användas för att stabilisera frakturen11,15.
Målet med denna studie var att utveckla en enkel och lätt att följa gnagarmodell som kunde hjälpa forskare att inte bara förstå utvecklingen av kallus efter lårbenets fraktur utan kan hjälpa till att avgöra om ett potentiellt läkemedel har benläkande egenskaper genom att förstå mekanismen genom vilken det verkar.
Denna metod beskriver tydligt de detaljer som behövs för att utveckla en fraktur osteotomi modell i Wistar albino råttor. Denna modell kan användas för att utvärdera den osteogena effekten av ett lovande osteoanaboliskt läkemedel vid frakturläkning, samt förstå komplikationerna med benläkning. Det framträdande med denna metod är att den är enkel och inte behöver för mycket tid eller sofistikerad utrustning. I denna metod valdes vuxna manliga Wistar-albinoråttor som gnagarmodell för experimenten. Enhetli…
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Central Council for Research in Homoeopathy (CCRH), ministeriet för AYUSH, Indiens regering, för forskningsfinansiering. Författarna är tacksamma för hjälp och stöd från Central Animal Facility, AIIMS, New Delhi, för deras hjälp och stöd med djurförsöken och CMET, AIIMS, New Delhi, för deras hjälp och stöd inom fotografering och videografi.
Alcohol | Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | MFG/MD/2019/000189 | Sterillium hand disinfectant |
Artery forceps | Nebula surgical, Gujarat, India | G.105.05S | 5", straight |
Bard-Parker handle | Nebula surgical, Gujarat, India | G.103.03 | Size number 3 |
Betadine solution | Win-medicare New Delhi, India | UP14250000001 | 10% w/v Povidone iodine solution |
Cat's-paw skin retractor | Nebula surgical, Gujarat, India | 908.S | Small |
EDTA | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 43272 | Disodium salt |
Eosin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 115935 | For preparing the staining solution |
Forceps (plain) | Nebula surgical, Gujarat, India | 115.06 | 6", plain |
Forceps (toothed) | Nebula surgical, Gujarat, India | 117.06 | 6", toothed |
Formaldehyde | Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India | 84439 | For preparing the neutral buffered formalin |
Haematoxylin | Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India | 104302 | For preparing the staining solution |
Hammer | Nebula surgical, Gujarat, India | 401.M | |
Injection Cefuroxime | Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India | 48/UA/SC/P-2013 | Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial |
Injection Ketamine | Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India | G/28-B/6 | Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL |
Injection Xylazine | Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India | 28/RR/AP/2009/F/G | Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL |
Injection Lignocaine | Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India | 1308-B | 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL |
Injection Tramadol | Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India | MB/07/500 | Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL |
K-wire | Nebula surgical, Gujarat, India | 166 (1mm) | 12", double ended |
Mechanical drill for inserting K-wire | Bosch, Germany | 06019F70K4 | GSR 120-LI Professional |
Metzenbaum cutting scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.121.06S | 6", straight |
Needle holder | Nebula surgical, Gujarat, India | G.108.06 | 6", straight |
Ophthalmic ointment | GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India | KTK/28a/467/2001 | Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP |
Osteotome (chisel) | Nebula surgical, Gujarat, India | 1001.S.10 | 10 mm, straight |
Periosteal elevator | Nebula surgical, Gujarat, India | 918.10.S | 10 mm, straight |
Pliers cum wire cutter | Nebula surgical, Gujarat, India | 604.65 | |
Reynold’s scissors | Nebula surgical, Gujarat, India | G.110.06S | 6", straight |
Standard semi-synthetic diet | Ashirvad Industries, Chandigarh, India | No catalog number available | Detailed composition provided in materials used |
Steel cup for keeping betadine for application | Local purchase | No catalog number available | |
Steel tray with lid for autoclaving instruments | Local purchase | No catalog number available | |
Sterile gauze | Ideal Healthcare Industries, Delhi, India | E(0047)/14/MNB/7951 | Sterile, 5cmx5cm, 12 ply |
Sterile marble block for support | Local purchase | No catalog number available | Locally fabricated; autoclavable |
Syringe and needle (1 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 303060 | 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle |
Syringe and needle (2 mL) | Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India | REF 307749 | 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle |
Syringe and needle (10 mL) | Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India | 334-B(H) | 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle |
Surgical blades (size no.15) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15115E | Sterile, Single use |
Surgical blades (size no.24) | Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA | REF MDS15124E | Sterile, Single use |
Sutures | Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India | SN 3318 | 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture |
Wax block in aluminium tray | Locally fabricated | No catalog number available | 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping) |
X-ray machine | Philips India Ltd, Gurugram, Haryana | SN19861013 | Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 |