Summary

Wistar Albino Sıçanlarında Femur Osteotomi Modeli Geliştirme Protokolü

Published: August 31, 2022
doi:

Summary

Burada, Wistar albino sıçanlarının femurunun şaftını iyatrojenik olarak kırmak ve nasır gelişimini takip etmek için bir protokol sunuyoruz. Bu femur osteotomi modeli, araştırmacıların kırık iyileşme sürecini değerlendirmelerine ve bir ilacın kırık iyileşmesini nasıl etkileyebileceğini incelemelerine yardımcı olabilir.

Abstract

Kırık iyileşmesi, osteoblastların ve osteoklastların koordineli etkisiyle kemik defektlerinin yenilenmesiyle sonuçlanan fizyolojik bir süreçtir. Osteoanabolik ilaçlar, kırıkların onarımını arttırma potansiyeline sahiptir, ancak yüksek maliyetler veya istenmeyen yan etkiler gibi kısıtlamalara sahiptir. Bir ilacın kemik iyileşme potansiyeli başlangıçta in vitro çalışmalarla belirlenebilir, ancak kavramın nihai kanıtı için in vivo çalışmalara ihtiyaç vardır. Amacımız, araştırmacıların femur şaftının kırılmasını takiben nasır oluşumunun gelişimini anlamalarına yardımcı olabilecek ve potansiyel bir ilacın kemik iyileştirici özelliklere sahip olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilecek bir femur osteotomi kemirgen modeli geliştirmekti. Yetişkin erkek Wistar albino sıçanları, Kurumsal Hayvan Etik Kurulu izninden sonra kullanıldı. Kemirgenler anestezi altına alındı ve aseptik koşullar altında, açık osteotomi kullanılarak femurların şaftlarının ortada üçte birinde tam enine kırıklar oluşturuldu. Kırıklar intramedüller K-teller kullanılarak azaltıldı ve internal olarak sabitlendi ve sekonder kırık iyileşmesinin gerçekleşmesine izin verildi. Ameliyattan sonra 5 gün boyunca intraperitoneal analjezikler ve antibiyotikler verildi. Sıralı haftalık röntgenler nasır oluşumunu değerlendirdi. Sıçanlar radyolojik olarak önceden belirlenmiş zaman noktalarına göre kurban edildi ve kırık nasır gelişimi radyolojik olarak ve immünohistokimya kullanılarak analiz edildi.

Introduction

Kemik, kemik oluşturan hücrelerden, osteoblastlardan ve kemik emici hücrelerden, osteoklastlardan oluşan yoğun bir bağ dokusudur. Kırık iyileşmesi, osteoblastların ve osteoklastların koordineli etkisiyle kemik defektlerinin yenilenmesiyle sonuçlanan fizyolojik bir süreçtir1. Kırık olduğunda, kırık bölgesinde osteoblastik ve osteoklastik aktivite kemik iyileşmesini belirleyen önemli faktörlerden bazılarıdır2. Kırık iyileşmesi normal seyrinden saptığında, gecikmiş bir birleşme, malunion veya birleşmeme ile sonuçlanır. 9 ay boyunca kırığın birleşme başarısızlığı olduğunda, son 3 ay içinde onarımın ilerlemesi olmadan bir kırığın birleşmediği söylenir3. Tüm kırıkların yaklaşık %10-15’inde nonunion 4’e kadar ilerleyebilecek bir onarım gecikmesiyaşanır. Tüm kırıklarda birleşmeme oranı %5-%10’dur ve tutulan kemiğe ve kırık bölgesine bağlı olarak değişir5.

Kırık kaynamamasının tedavisinde mevcut rejim cerrahi ve/veya tıbbi modaliteleri içermektedir. Şu anda, gecikmiş veya kırıkların birleşmemesi, kemik grefti gibi cerrahi stratejilerle aşılabilir. Bununla birlikte, kemik greftlemenin greft dokusunun mevcudiyeti, donör bölge ağrısı, morbidite ve enfeksiyon gibi sınırlamaları ve komplikasyonları vardır6. Tıbbi tedavi, kemik morfogenetik proteini (BMP) ve teriparatid (parathormon analogu) gibi osteoanabolik ilaçları içerir. Şu anda kullanılan osteoanabolik ajanlar, kırıkların onarımını arttırma potansiyeline sahiptir, ancak fahiş maliyetler veya istenmeyen yan etkiler gibi kısıtlamalara sahiptir7. Bu nedenle, kemik iyileşmesi için uygun maliyetli, cerrahi olmayan alternatifleri belirleme kapsamı vardır. Bir ilacın kemik iyileşme potansiyeli başlangıçta in vitro çalışmalarla belirlenebilir, ancak kavramın nihai kanıtı için in vivo çalışmalara ihtiyaç vardır. Kemik iyileşmesini arttırdığı bilinen bir ilaç in vitro olarak değerlendirilmeli ve umut verici bulunursa in vivo hayvan modeli çalışmaları için kullanılabilir. İlaç in vivo modelde kemik oluşumunu ve yeniden şekillenmesini teşvik ettiğini kanıtlarsa, bir sonraki aşamaya (yani klinik çalışmalara) geçebilir.

Hayvanlarda kırık iyileşmesini değerlendirmek, insan denemelerinden geçmeden önce kemik iyileşmesi için tanıtılan yeni bir ajanı değerlendirmek için ileriye doğru atılmış mantıklı bir adımdır. Kırık iyileşmesi ile ilgili in vivo hayvan modeli çalışmaları için, kemirgenler giderek daha popüler bir model haline gelmiştir8. Kemirgen modelleri, düşük işletme maliyetleri, sınırlı alan ihtiyacı ve kemik iyileşmesi için daha az zaman harcanması nedeniyle artan ilgi yaratmıştır9. Ek olarak, kemirgenler, kemik iyileşmesi ve yenilenmesinin moleküler mekanizmaları üzerine çalışmalara izin veren geniş bir antikor ve gen hedefleri spektrumuna sahiptir10. Bir fikir birliği toplantısı, çeşitli küçük hayvan kemik iyileştirme modellerini kapsamlı bir şekilde vurguladı ve kemik iyileşmesini etkileyen farklı parametrelere odaklandı, ayrıca birkaç küçük hayvan kırığı modeli ve implantı vurguladı11.

Temel kırılma modelleri genel olarak açık veya kapalı modellere ayrılabilir. Kapalı kırık modelleri, kemik üzerinde üç veya dört noktalı bir bükme kuvveti kullanır ve geleneksel bir cerrahi yaklaşım gerektirmez. İnsanlarda uzun kemik kırıklarına benzeyen eğik veya spiral kırıklara yol açarlar, ancak kırık yerinin ve boyutlarının standardizasyonunun olmaması bunlarda kafa karıştırıcı bir faktör olarak hareket edebilir12. Açık kırık modelleri, kemiğin osteotomisi için cerrahi erişim gerektirir, kırık bölgesinde daha tutarlı bir kırık paterni elde edilmesine yardımcı olur, ancak kapalı modellere kıyasla gecikmiş iyileşme ile ilişkilidir13. Kırık iyileşmesini incelemek için kullanılan kemik seçimi, boyutları ve erişilebilirlikleri nedeniyle esas olarak tibia ve femur olarak kalır. Kırık yerinin seçimi genellikle diyafiz veya metafizdir. Metafiz bölgesi, osteoporotik deneklerde kırık iyileşmesinin çalışıldığı durumlarda özel olarak seçilir, çünkü metafiz osteoporozdan daha fazla etkilenir14. İntramedüller pimler ve eksternal fiksatörler gibi çeşitli implantlar kırık 11,15’i stabilize etmek için kullanılabilir.

Bu çalışmanın amacı, araştırmacıların sadece femur kırığını takiben nasır gelişimini anlamalarına yardımcı olmakla kalmayıp, aynı zamanda potansiyel bir ilacın hareket ettiği mekanizmayı anlayarak kemik iyileştirici özelliklere sahip olup olmadığını belirlemeye yardımcı olabilecek basit ve takip edilmesi kolay bir kemirgen modeli geliştirmekti.

Protocol

Hayvan deneyleri, Kurumsal Hayvan Etiği Komitesi (IAEC), AIIMS, Yeni Delhi, Hindistan’dan (286/IAEC-1/2021) etik onay alındıktan sonra yapılmıştır. 1. Preoperatif prosedür Ev erkek Wistar albino sıçanları, her biri 150-200 g ağırlığında, ayrı ayrı kafeslerde bir Merkezi Hayvan Tesisi’nde (CAF) 6-8 haftalıktır. Bu, birden fazla sıçan kafesleri paylaştığında cerrahi / kırık bölgesi yaralanması olmamasını sağlar. Sıçanları% …

Representative Results

Bu çalışma Wistar albino sıçanlarında femur osteotomi modeli geliştirmek amacıyla yapılmıştır. Bu model, kemik iyileşmesini ve umut verici bir osteoanabolik ilacın kemik iyileşmesinde osteojenik etkisini değerlendirmek için kullanılabilir. Standart cerrahi önlemler ve protokoller takip edildi. İşlem için steril önlükler, perdeler ve cerrahi ekipmanlar kullanıldı (Şekil 1). Ekipman (Tablo 1) ameliyattan 48 saat önce sterilize edildi. Hayvanların h…

Discussion

Bu yöntem, Wistar albino sıçanlarında kırık osteotomi modeli geliştirmek için gereken ayrıntıları açıkça açıklamaktadır. Bu model, umut verici bir osteoanabolik ilacın kırık iyileşmesindeki osteojenik etkisini değerlendirmek ve kemik iyileşmesinin inceliklerini anlamak için kullanılabilir. Bu yöntemin göze çarpan özelliği, basit olması ve çok fazla zamana veya sofistike ekipmana ihtiyaç duymamasıdır. Bu yöntemde, deneyler için kemirgen modeli olarak yetişkin erkek Wistar albino sıç…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, araştırma finansmanı için Hindistan Hükümeti AYUSH Bakanlığı, Homeopati Araştırmaları Merkez Konseyi’ne (CCRH) teşekkür eder. Yazarlar, Central Animal Facility, AIIMS, New Delhi’nin hayvan deneylerine olan yardımları ve destekleri için ve CMET, AIIMS, Yeni Delhi’nin fotoğraf ve videografideki yardım ve destekleri için teşekkür eder.

Materials

Alcohol Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India MFG/MD/2019/000189 Sterillium hand disinfectant
Artery forceps  Nebula surgical, Gujarat, India G.105.05S 5", straight
Bard-Parker handle  Nebula surgical, Gujarat, India G.103.03 Size number 3
Betadine solution Win-medicare New Delhi, India UP14250000001 10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor  Nebula surgical, Gujarat, India 908.S Small
EDTA Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India 43272 Disodium salt
Eosin Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India 115935 For preparing the staining solution 
Forceps (plain) Nebula surgical, Gujarat, India 115.06 6", plain
Forceps (toothed) Nebula surgical, Gujarat, India 117.06 6", toothed
Formaldehyde Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India 84439 For preparing the neutral buffered formalin 
Haematoxylin Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India 104302 For preparing the staining solution 
Hammer Nebula surgical, Gujarat, India 401.M
Injection Cefuroxime Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India 48/UA/SC/P-2013 Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial 
Injection Ketamine Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India G/28-B/6 Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL 
Injection Xylazine Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India 28/RR/AP/2009/F/G Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India  1308-B 2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol  Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India MB/07/500 Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire  Nebula surgical, Gujarat, India 166 (1mm) 12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire ‎Bosch, Germany  06019F70K4 GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors  Nebula surgical, Gujarat, India G.121.06S 6", straight
Needle holder Nebula surgical, Gujarat, India G.108.06 6", straight
Ophthalmic ointment  GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India KTK/28a/467/2001 Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel) Nebula surgical, Gujarat, India 1001.S.10 10 mm, straight
Periosteal elevator  Nebula surgical, Gujarat, India 918.10.S 10 mm, straight
Pliers cum wire cutter Nebula surgical, Gujarat, India 604.65
Reynold’s scissors Nebula surgical, Gujarat, India G.110.06S 6", straight
Standard semi-synthetic diet  Ashirvad Industries, Chandigarh, India No catalog number available Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application Local purchase No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments Local purchase No catalog number available
Sterile gauze Ideal Healthcare Industries, Delhi, India  E(0047)/14/MNB/7951 Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support Local purchase No catalog number available Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)  Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India REF 303060 1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)  Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India REF 307749 2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)  Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India  334-B(H) 10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15) Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA REF MDS15115E Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24) Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA REF MDS15124E Sterile, Single use
Sutures Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India SN 3318 4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture 
Wax block in aluminium tray  Locally fabricated No catalog number available 30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine Philips India Ltd, Gurugram, Haryana SN19861013 Model: Philips Digital Diagnost R 4.2 

Riferimenti

  1. Wang, T., Zhang, X., Bikle, D. D. Osteogenic differentiation of periosteal cells during fracture healing. Journal of Cellular Physiology. 232 (5), 913-921 (2017).
  2. Fakhry, M., Hamade, E., Badran, B., Buchet, R., Magne, D. Molecular mechanisms of mesenchymal stem cell differentiation towards osteoblasts. World Journal of Stem Cells. 5 (4), 136-148 (2013).
  3. Bishop, J. A., Palanca, A. A., Bellino, M. J., Lowenberg, D. W. Assessment of compromised fracture healing. JAAOS – Journal of the American Academy of Orthopaedic Surgeons. 20 (5), 273-282 (2012).
  4. Fong, K., et al. Predictors of nonunion and reoperation in patients with fractures of the tibia: an observational study. BMC Musculoskeletal Disorders. 14 (1), 103 (2013).
  5. Ramoutar, D. N., Rodrigues, J., Quah, C., Boulton, C., Moran, C. G. Judet decortication and compression plate fixation of long bone nonunion: Is bone graft necessary. Injury. 42 (12), 1430-1434 (2011).
  6. Goulet, J. A., Senunas, L. E., DeSilva, G. L., Greenfield, M. L. V. H. Autogenous iliac crest bone graft: Complications and functional assessment. Clinical Orthopaedics and Related Research. 339, 76-81 (1997).
  7. Stevenson, M., et al. A systematic review and economic evaluation of alendronate, etidronate, risedronate, raloxifene and teriparatide for the prevention and treatment of postmenopausal osteoporosis. Health Technology Assessment. 9 (22), 1 (2005).
  8. Haffner-Luntzer, M., Kovtun, A., Rapp, A. E., Ignatius, A. Mouse models in bone fracture healing research. Current Molecular Biology Reports. 2 (2), 101-111 (2016).
  9. Mills, L. A., Simpson, A. H. R. W. In vivo models of bone repair. The Journal of Bone and Joint Surgery. British Volume. 94 (7), 865-874 (2012).
  10. Houdebine, L. -. M., Sioud, M. Transgenic Animal Models in Biomedical Research. Target Discovery and Validation Reviews and Protocols: Volume 1, Emerging Strategies for Targets and Biomarker Discovery. , (2007).
  11. Histing, T., et al. Small animal bone healing models: Standards, tips and pitfalls results of a consensus meeting. Bone. 49 (4), 591-599 (2011).
  12. Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
  13. Klein, M., et al. Comparison of healing process in open osteotomy model and open fracture model: delayed healing of osteotomies after intramedullary screw fixation. Journal of Orthopaedic Research. 33 (7), 971-978 (2015).
  14. Kolios, L., et al. Do estrogen and alendronate improve metaphyseal fracture healing when applied as osteoporosis prophylaxis. Calcified Tissue International. 86 (1), 23-32 (2010).
  15. Holstein, J. H., et al. Advances in the establishment of defined mouse models for the study of fracture healing and bone regeneration. Journal of Orthopaedic Trauma. 23, 31-38 (2009).
  16. Umiatin, U., Dilogo, I. H., Sari, P., Wijaya, S. K. Histological analysis of bone callus in delayed union model fracture healing stimulated with pulsed electromagnetic fields (PEMF). Scientifica. 2021, 4791172 (2021).
  17. Han, W., et al. The osteogenic potential of human bone callus. Scientific Reports. 6, 36330 (2016).
  18. Haffner-Luntzer, M., et al. A novel mouse model to study fracture healing of the proximal femur. Journal of Orthopaedic Research. 38 (10), 2131-2138 (2020).
  19. Aurégan, J. C., et al. The rat model of femur fracture for bone and mineral research: An improved description of expected comminution, quantity of soft callus and incidence of complications. Bone & Joint Research. 2 (8), 149-154 (2013).
  20. Li, Z., Helms, J. A. Drill hole models to investigate bone repair. Methods in Molecular Biology. 2221, 193-204 (2021).
  21. Handool, K. O., et al. Optimization of a closed rat tibial fracture model. Journal of Experimental Orthopaedics. 5 (1), 13 (2018).
  22. Kobata, S. I., et al. Prevention of bone infection after open fracture using a chitosan with ciprofloxacin implant in animal model. Acta Cirurgica Brasileira. 35 (8), 202000803 (2020).
check_url/it/63712?article_type=t

Play Video

Citazione di questo articolo
Aryal, A., Pagaku, P. K., Dey, D., Tyagi, S., Shrivastava, V., Bhattacharya, A., Rani, S., Nayak, D., Khurana, A., Khanna, P., Goyal, A., Mridha, A. R., Garg, B., Sen, S. Protocol for Developing a Femur Osteotomy Model in Wistar Albino Rats. J. Vis. Exp. (186), e63712, doi:10.3791/63712 (2022).

View Video