Zelltypspezifische Proteinreinigung und Identifizierung aus komplexen Geweben unter Verwendung einer mutierten Methionin-tRNA-Synthetase-Mauslinie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie eine zelltypspezifische Proteinmarkierung mit Azidonorleucin (ANL) unter Verwendung einer Mauslinie durchgeführt wird, die eine mutierte L274G-Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*) exprimiert, und die notwendigen Schritte zur Isolierung markierter zelltypspezifischer Proteine. Wir skizzieren zwei mögliche ANL-Verabreichungswege bei lebenden Mäusen durch (1) Trinkwasser und (2) intraperitoneale Injektionen.
Abstract
Das Verständnis der Proteinhomöostase in vivo ist der Schlüssel zum Wissen, wie die Zellen sowohl unter physiologischen als auch unter Krankheitsbedingungen funktionieren. Das vorliegende Protokoll beschreibt die In-vivo-Markierung und anschließende Reinigung neu synthetisierter Proteine unter Verwendung einer manipulierten Mauslinie, um die Proteinmarkierung an bestimmte Zellpopulationen zu richten. Es handelt sich um eine induzierbare Linie durch Cre-Rekombinase-Expression der L274G-Methionin-tRNA-Synthetase (MetRS*), die einen Einbau von Azidonorleucin (ANL) in die Proteine ermöglicht, der sonst nicht auftritt. Mit der hier beschriebenen Methode ist es möglich, zelltypspezifische Proteome, die in vivo markiert sind, zu reinigen und subtile Veränderungen des Proteingehalts aufgrund der Reduktion der Probenkomplexität zu erkennen.
Introduction
Aberrante Proteinhomöostase wird durch ein Ungleichgewicht in der Proteinsynthese und -abbau verursacht. Mehrere Krankheiten stehen im Zusammenhang mit Veränderungen der Proteinhomöostase. Das Kennzeichen einiger Krankheiten ist das Vorhandensein von Aggregaten an verschiedenen subzellulären Orten und Gehirnbereichen. Die Proteinhomöostase ist nicht nur bei Krankheiten wichtig, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle bei der normalen Organ- und Zellfunktion1. Zum Beispiel ist die Proteinsynthese für viele Formen der neuronalen Plastizitätnotwendig 2,3, wie durch die Verwendung chemischer Inhibitoren bestimmt, die die Proteinsynthese blockieren4. Es ist jedoch weder klar, bei welchen Zelltypen das Proteom verändert wird, um Lernen und Gedächtnis zu unterstützen, noch ist bekannt, welche spezifischen Proteine in jedem Zelltyp ihre Synthese oder ihren Abbau erhöhen oder verringern. Daher erfordert eine umfassende Untersuchung der Proteinhomöostase die Fähigkeit, Proteome aus bestimmten Zelltypen zu unterscheiden. Tatsächlich war die Identifizierung zelltypspezifischer Proteome zur Untersuchung zellulärer Prozesse, die in einer mehrzelligen Umgebung ablaufen, eine wichtige Hürde in der Proteomik. Aus diesem Grund haben wir eine Technik entwickelt, die MetRS*-Expression in Kombination mit bioorthogonalen Methoden verwendet, die sich als effektiver Weg zur Identifizierung und Reinigung zelltypspezifischer Proteome erwiesen hat und diese Lücke füllt 5,6,7.
Die Expression eines mutierten MetRS* (MetRS L274G) ermöglicht das Laden des nicht-kanonischen Methionin-Analogons ANL in die entsprechende tRNA 8,9 und dessen anschließenden Einbau in Proteine. Wenn die MetRS*-Expression durch einen zelltypspezifischen Promotor reguliert wird, wird die nicht-kanonische Aminosäure zellselektiv in die Proteine eingebaut. Sobald ANL in die Proteine eingebaut ist, kann es selektiv durch Klickchemie funktionalisiert und anschließend entweder durch Bildgebung (FUNCAT) oder durch Western Immunoblot (BONCAT) sichtbar gemacht werden. Alternativ können Proteine selektiv gereinigt und mittels Massenspektrometrie (MS) identifiziert werden. Mit dieser Technologie haben wir eine Mauslinie erstellt, die das MetRS*-Protein unter der Kontrolle der Cre-Rekombinase exprimiert. Angesichts der steigenden Anzahl verfügbarer Cre-Maus-Linien kann das MetRS*-System in jedem Bereich verwendet werden, um jeden Zelltyp aus jedem Gewebe zu untersuchen, für das es eine bestehende Cre-Linie gibt. Die Proteinmarkierung mit ANL ist in vitro oder in vivo möglich und verändert weder das Verhalten der Maus noch die Proteinintegrität6. Die Markierungszeit kann an die wissenschaftliche Fragestellung jedes Forschers angepasst werden, indem neu synthetisierte Proteine (kürzere Markierungszeiten) oder ganze Proteome (längere Markierungszeiten) markiert werden. Die Verwendung dieser Technik ist durch die Anzahl der Zellen des Typs begrenzt, den der Forscher zu untersuchen bereit ist; Daher ist eine Proteinisolierung aus Zelltypen mit geringer Anzahl oder niedrigen Stoffwechselraten mit dieser Methode nicht möglich. Ziel der vorgestellten Methode ist es, zelltypspezifische Proteine/Proteome zu identifizieren, die in vivo markiert sind. In diesem Protokoll beschreiben wir, wie zelltypspezifische Proteome mit ANL in lebenden Mäusen markiert und die markierten Proteine gereinigt werden. Nach der Reinigung können Proteine durch routinemäßige Massenspektrometrieprotokolle 5,10 identifiziert werden. Die Reduzierung der Probenkomplexität, die bei dieser Methode durch die selektive Reinigung von Proteinen aus bestimmten Zellpopulationen erreicht wird, ermöglicht es dem Experimentator, subtile Veränderungen in Proteomen zu erkennen, beispielsweise als Reaktion auf Umweltveränderungen. Die Reinigung der markierten Proteine kann in ~10 Tagen erreicht werden, ohne die MS-Analyse oder die Markierungsperiode. Hier beschreiben wir zwei Methoden zur ANL-Verabreichung an MetRS*-exprimierende Mäuse, nämlich (1) Zugabe der Aminosäure im Trinkwasser und (2) Einführung von ANL durch intraperitoneale Injektionen. Unabhängig von der für die ANL-Verabreichung gewählten Methode sind die Isolations- und Reinigungsschritte die gleichen (ab Schritt 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die kritischen Aspekte des Protokolls sind: die Einbeziehung von Negativkontrollen, genügend biologische Replikate, ANL-Verabreichungsweg, Menge und Dauer, Alkylierung der Proben, Alkinkonzentration und β-Mercaptoethanol-Eliminierung bei Verwendung von DST-Alkin.
Es ist wichtig, Negativkontrollproben von ANL-markierten Tieren ohne Cre-Treiber und daher ohne MetRS*-Expression einzubeziehen. Diese Proben müssen jedem im Protokoll beschriebenen Schritt parallel zu den Proben von ANL-markierten…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.A-C wird vom spanischen Ministerium für Wissenschaft und Innovation (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), von der Autonomen Gemeinschaft Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) und MICINN (PID2020-113270RA-I00) finanziert. R. A-P wird von der Autonomen Gemeinschaft Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) finanziert. E.M.S. wird gefördert durch die Max-Planck-Gesellschaft, einen Advanced Investigator Award des Europäischen Forschungsrats (grant 743216), den DFG-SFB 1080: Molekulare und zelluläre Mechanismen der neuronalen Homöostase und den DFG-SFB 902: Molekulare Prinzipien der RNA-basierten Regulation. Wir danken D.C. Dieterich und P. Landgraf für ihre technische Beratung und die Synthese des DST-Alkin. Wir danken E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast und der Tiereinrichtung des MPI für Hirnforschung für die hervorragende Unterstützung. Wir danken Sandra Goebbels für das Teilen der Nex-Cre Mauslinie. Wir danken Antonio G. Carroggio für seine Hilfe bei der englischen Redaktion. B.A-C. entwarf, führte und analysierte Experimente. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. und S. t. D. führte Experimente durch und analysierte sie. B.A-C und E.M.S. entwarfen Experimente und überwachten das Projekt, B.A-C schrieb das Papier. Alle Autoren haben das Papier bearbeitet.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
Riferimenti
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