変異型メチオニンtRNA合成酵素マウス株を用いた複合体組織からの細胞型特異的タンパク質精製・同定
Summary
このプロトコルでは、変異型L274G-メチオニンtRNA合成酵素(MetRS*)を発現するマウス株を使用して、アジドノールロイシン(ANL)による細胞種特異的タンパク質標識を実行する方法と、標識された細胞種特異的タンパク質の単離に必要な手順について説明します。生きたマウスにおける2つの可能なANL投与経路を、(1)飲料水と(2)腹腔内注射によって概説します。
Abstract
in vivoでのタンパク質恒常性を理解することは、生理学的条件と疾患状態の両方で細胞がどのように機能するかを知るための鍵です。本プロトコルは、タンパク質標識を特定の細胞集団に向けるために改変されたマウス系統を使用して、新たに合成されたタンパク質のin vivo標識およびその後の精製を記載する。これは、L274G-メチオニンtRNA合成酵素(MetRS*)のCreリコンビナーゼ発現による誘導可能な系統であり、他の方法では起こらないタンパク質へのアジドノルロイシン(ANL)の取り込みを可能にします。ここで説明した方法を使用すると、in vivoで標識された細胞種特異的プロテオームを精製し、サンプルの複雑さの減少によるタンパク質含有量の微妙な変化を検出することができます。
Introduction
異常なタンパク質恒常性は、タンパク質の合成と分解の不均衡によって引き起こされます。いくつかの疾患は、タンパク質恒常性の変化に関連しています。いくつかの疾患の特徴は、異なる細胞内位置および脳領域に凝集体が存在することです。タンパク質の恒常性は、疾患において重要であるだけでなく、正常な臓器および細胞機能においても重要な役割を果たします1。例えば、タンパク質合成は、タンパク質合成を阻害する化学阻害剤の使用によって決定されるように、多くの形態のニューロン可塑性2,3に必要である4。しかし、学習と記憶をサポートするためにプロテオームがどの細胞型で変化しているかは明らかではなく、各細胞型のどの特定のタンパク質がそれらの合成または分解において増加または減少するかも理解されていません。したがって、タンパク質の恒常性を包括的に研究するには、特定の細胞型に由来するプロテオームを区別する能力が必要です。実際、多細胞環境で起こる細胞プロセスを研究するための細胞種特異的プロテオームの同定は、プロテオミクスにおける重要なハードルでした。このため、MetRS*発現と生体直交法を組み合わせた技術を開発し、細胞型特異的プロテオームを同定および精製する効果的な方法であることが証明され、このギャップを埋めました5,6,7。
変異体MetRS*(MetRS L274G)の発現により、非標準的なメチオニン類似体ANLを対応するtRNA 8,9にロードし、その後タンパク質に組み込むことができます。MetRS*発現が細胞型特異的プロモーターによって調節されると、非標準アミノ酸が細胞選択的にタンパク質に取り込まれます。ANLがタンパク質に組み込まれると、クリックケミストリーによって選択的に機能化され、その後、イメージング(FUNCAT)またはウエスタンイムノブロット(BONCAT)によって視覚化されます。あるいは、タンパク質を選択的に精製し、質量分析(MS)によって同定することができる。この技術を用いて、Creリコンビナーゼの制御下でMetRS*タンパク質を発現するマウス株を作製しました。利用可能なCreマウス株の数が増えていることを考慮すると、MetRS*システムは、既存のCre-lineが存在するあらゆる組織からあらゆる細胞タイプを研究するために、あらゆる分野で使用することができます。ANLによるタンパク質標識は、in vitroまたはin vivoで可能であり、マウスの行動やタンパク質の完全性を変化させません6。標識期間は、各研究者の科学的問題に適合させることができ、新しく合成されたタンパク質(より短い標識時間)またはプロテオーム全体(より長い標識時間)を標識します。この技術の使用は、研究者が研究を希望するタイプの細胞の数によって制限されます。したがって、この方法では、数が少ない、または代謝率が低い細胞型からのタンパク質の単離は不可能です。提示された方法の目標は、in vivoで標識された細胞型特異的タンパク質/プロテオームを特定することです。このプロトコルでは、生きたマウスで細胞種特異的プロテオームをANLで標識し、標識タンパク質を精製する方法について説明しています。精製後、タンパク質は、ルーチン質量分析プロトコル5、10によって同定することができる。特定の細胞集団からのタンパク質の選択的精製によってこの方法において達成される試料の複雑さの低減は、例えば環境変化に応答して、プロテオームの微妙な変化を検出することを可能にする。標識タンパク質の精製は、MS分析や標識期間を含まない~10日で達成できます。ここでは、MetRS*発現マウスへのANL投与の2つの方法、すなわち(1)飲料水にアミノ酸を添加する方法と、(2)腹腔内注射によるANLの導入方法について説明する。ANL投与に選択した方法に関係なく、分離および精製のステップは同じです(ステップ2以降)。
Protocol
Representative Results
Discussion
プロトコルの重要な側面は次のとおりです。陰性対照を含めること、十分な生物学的複製を有すること、ANL投与経路、量、および期間、サンプルのアルキル化、アルキン濃度、およびDST-アルキンを使用する場合のβ-メルカプトエタノールの除去。
Creドライバーなしで、したがってMetRS*発現のないANL標識動物から進行する陰性対照サンプルを含めることが重要です。これ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.A-Cは、スペイン科学イノベーション省(Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I)、マドリード自治州(Atracción de Talento-2019T1 / BMD-14057)、およびMICINN(PID2020-113270RA-I00)の助成金によって資金提供されています。R. A-Pは、マドリード自治州(Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057)から資金提供を受けています。E.M.S.は、欧州研究会議の上級研究者賞であるマックスプランク協会(助成金743216)、DFG CRC 1080:神経恒常性の分子および細胞メカニズム、およびDFG CRC 902:RNAベースの制御の分子原理によって資金提供されています。我々は、D.C DieterichとP. Landgrafの技術的助言とDST-Alkyneの合成に感謝する。E. Northrup、S. Zeissler、S. Gil Mast、およびMPI for Brain Researchの動物施設の優れたサポートに感謝します。Nex-Creマウスラインを共有してくれたサンドラゲッベルスに感謝します。アントニオ・G・カロッジョ氏の英文校正にご協力いただき、ありがとうございました。学士実験を設計、実施、分析しました。B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E., および S. T.D.実験を実施し、分析した。B.A-CとE.M.S.は実験を設計し、プロジェクトを監督し、B.A-Cは論文を書いた。すべての著者が論文を編集した。
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
Riferimenti
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