Purificação e identificação de proteínas específicas do tipo celular de tecidos complexos usando uma linha de camundongo mutante de metionina tRNA sintetase
Summary
Este protocolo descreve como realizar a marcação de proteína específica do tipo celular com azidonorleucina (ANL) usando uma linha de camundongo expressando uma L274G-Metionina tRNA sintetase mutante (MetRS*) e as etapas necessárias para o isolamento de proteínas específicas do tipo celular marcadas. Delineamos duas possíveis vias de administração de ANL em camundongos vivos por (1) água potável e (2) injeções intraperitoneais.
Abstract
Compreender a homeostase proteica in vivo é fundamental para saber como as células funcionam em condições fisiológicas e de doença. O presente protocolo descreve a marcação in vivo e a subsequente purificação de proteínas recém-sintetizadas usando uma linha de camundongos modificados para direcionar a marcação de proteínas para populações celulares específicas. É uma linhagem induzível pela expressão da Cre recombinase da L274G-Metionina tRNA sintetase (MetRS*), possibilitando a incorporação de azidonorleucina (ANL) às proteínas, o que de outra forma não ocorrerá. Usando o método descrito aqui, é possível purificar proteomas específicos do tipo celular marcados in vivo e detectar mudanças sutis no teor de proteína devido à redução da complexidade da amostra.
Introduction
A homeostase proteica aberrante é causada por um desequilíbrio na síntese e degradação de proteínas. Diversas doenças estão relacionadas a alterações na homeostase proteica. A marca registrada de algumas doenças é a presença de agregados em diferentes locais subcelulares e áreas cerebrais. A homeostase proteica não é apenas importante na doença, mas também desempenha um papel crucial na função normal dos órgãos e células1. Por exemplo, a síntese proteica é necessária para muitas formas de plasticidade neuronal2,3, conforme determinado pelo uso de inibidores químicos que bloqueiam a síntese proteica4. No entanto, não está claro em quais tipos de células o proteoma é alterado para apoiar a aprendizagem e a memória, nem se entende quais proteínas específicas em cada tipo de célula aumentam ou diminuem sua síntese ou degradação. Assim, um estudo abrangente da homeostase de proteínas requer a capacidade de diferenciar proteomas provenientes de tipos específicos de células. De fato, a identificação de proteomas específicos do tipo celular para estudar processos celulares que ocorrem em um ambiente multicelular tem sido um obstáculo importante na proteômica. Por esse motivo, desenvolvemos uma técnica utilizando a expressão de MetRS* combinada com métodos bioortogonais que tem se mostrado uma forma eficaz de identificar e purificar proteomas específicos do tipo celular, preenchendo essa lacuna 5,6,7.
A expressão de um MetRS* mutante (MetRS L274G) permite a carga do ANL análogo à metionina não canônico no RNAt 8,9 correspondente e sua subsequente incorporação em proteínas. Quando a expressão de MetRS* é regulada por um promotor específico do tipo celular, o aminoácido não canônico será incorporado às proteínas de maneira seletiva celular. Uma vez que o ANL é incorporado nas proteínas, ele pode ser seletivamente funcionalizado por click-chemistry e, posteriormente, visualizado por imagem (FUNCAT) ou por Western Immunoblot (BONCAT). Alternativamente, as proteínas podem ser seletivamente purificadas e identificadas por espectrometria de massa (EM). Usando essa tecnologia, criamos uma linha de camundongo expressando a proteína MetRS* sob o controle da Cre recombinase. Considerando o crescente número de linhas de camundongos Cre disponíveis, o sistema MetRS* pode ser usado em qualquer campo para estudar qualquer tipo de célula de qualquer tecido para o qual exista uma linha Cre existente. A marcação de proteínas com ANL é possível in vitro ou in vivo, e não altera o comportamento do camundongo ou a integridade da proteína6. O período de tempo de rotulagem pode ser adaptado à questão científica de cada pesquisador, marcando proteínas recém-sintetizadas (tempos de rotulagem mais curtos) ou proteomas inteiros (tempos de rotulagem mais longos). O uso dessa técnica é limitado pelo número de células do tipo que o pesquisador está disposto a estudar; portanto, o isolamento proteico de tipos de células com baixo número ou baixas taxas metabólicas não é possível por este método. O objetivo do método apresentado é identificar proteínas/proteomas específicos do tipo celular marcados in vivo. Neste protocolo, descrevemos como rotular proteomas específicos do tipo celular com ANL em camundongos vivos e purificar as proteínas marcadas. Após a purificação, as proteínas podem ser identificadas por protocolos de espectrometria de massas de rotina 5,10. A redução da complexidade da amostra alcançada neste método pela purificação seletiva de proteínas de populações celulares específicas permite ao experimentador detectar mudanças sutis nos proteomas, por exemplo, em resposta a mudanças ambientais. A purificação das proteínas marcadas pode ser alcançada em ~10 dias, não incluindo a análise de EM ou o período de rotulagem. Aqui, descrevemos dois métodos para a administração de ANL em camundongos que expressam MetRS*, a saber: (1) adição do aminoácido na água potável e (2) introdução de ANL por injeções intraperitoneais. Independentemente do método escolhido para a administração de ANL, as etapas de isolamento e purificação são as mesmas (a partir da etapa 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Os aspectos críticos do protocolo são; a inclusão de controles negativos, com replicações biológicas suficientes, via de administração de ANL, quantidade e duração, alquilação das amostras, concentração de alquinos e eliminação de β-mercaptoetanol ao usar o DST-alquino.
É fundamental incluir amostras de controle negativas provenientes de animais marcados com ANL sem condutor Cre e, portanto, sem expressão MetRS*. Essas amostras devem ser submetidas a todas as etapas descrita…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O B.A-C é financiado pelo Ministério da Ciência e Inovação espanhol (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), pela Comunidade Autónoma de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057) e pelas subvenções MICINN (PID2020-113270RA-I00). A R. A-P é financiada pela Comunidade Autónoma de Madrid (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). O E.M.S. é financiado pela Max Planck Society, um prêmio de Investigador Avançado do Conselho Europeu de Pesquisa (subvenção 743216), DFG CRC 1080: Molecular and Cellular Mechanisms of Neural Homeostasis e DFG CRC 902: Molecular Principles of RNA-based Regulation. Agradecemos a D.C Dieterich e P. Landgraf por seu conselho técnico e pela síntese do DST-Alkyne. Agradecemos a E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast e à instalação de animais do MPI for Brain Research por seu excelente apoio. Agradecemos a Sandra Goebbels por compartilhar a linha de mouse Nex-Cre. Agradecemos a Antonio G. Carroggio por sua ajuda com a edição em inglês. B.A-C. projetou, conduziu e analisou experimentos. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C. E. e S. t. D. realizou e analisou experimentos. B.A-C e E.M.S. projetaram experimentos e supervisionaram o projeto, B.A-C escreveu o artigo. Todos os autores editaram o artigo.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
Riferimenti
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