Очистка и идентификация специфических белков клеточного типа из сложных тканей с использованием мышиной линии мутантной метиониновой тРНК-синтетазы
Summary
Этот протокол описывает, как выполнять маркировку белка клеточного типа с помощью азидонорлейцина (ANL) с использованием мышиной линии, экспрессирующей мутантную L274G-метионин-тРНК-синтетазу (MetRS*), и необходимые шаги для выделения меченых белков клеточного типа. Мы описываем два возможных пути введения ANL у живых мышей путем (1) питьевой воды и (2) внутрибрюшинных инъекций.
Abstract
Понимание белкового гомеостаза in vivo является ключом к пониманию того, как клетки работают как в физиологических, так и в болезненных условиях. Настоящий протокол описывает маркировку in vivo и последующую очистку вновь синтезированных белков с использованием инженерной мышиной линии для направления маркировки белка в конкретные клеточные популяции. Это индуцируемая линия cre рекомбиназы экспрессии L274G-метионин тРНК-синтетазы (MetRS*), обеспечивающая включение азидонорлейцина (ANL) в белки, что в противном случае не произойдет. Используя метод, описанный здесь, можно очистить специфические для клеток протеомы, помеченные in vivo , и обнаружить тонкие изменения в содержании белка из-за снижения сложности образца.
Introduction
Аберрантный белковый гомеостаз вызван дисбалансом в синтезе и деградации белка. Некоторые заболевания связаны с изменениями в белковом гомеостазе. Отличительной чертой некоторых заболеваний является наличие агрегатов в разных субклеточных местах и областях мозга. Белковый гомеостаз не только важен при заболевании, но и играет решающую роль в нормальной функции органов и клеток1. Например, синтез белка необходим для многих форм нейрональной пластичности 2,3, что определяется применением химических ингибиторов, блокирующих синтез белка4. Однако неясно, в каких типах клеток протеом изменяется для поддержки обучения и памяти, и непонятно, какие специфические белки в каждом типе клеток увеличивают или уменьшают их синтез или деградацию. Таким образом, всестороннее изучение белкового гомеостаза требует способности дифференцировать протеомы, поступающие от определенных типов клеток. Действительно, идентификация специфических для клеточного типа протеомов для изучения клеточных процессов, происходящих в многоклеточной среде, была важным препятствием в протеомике. По этой причине мы разработали методику с использованием экспрессии MetRS* в сочетании с биоортогональными методами, которая оказалась эффективным способом выявления и очистки специфических протеомов клеточного типа, заполнив этот пробел 5,6,7.
Экспрессия мутантного MetRS* (MetRS L274G) позволяет загружать неканонический аналог метионина ANL в соответствующую тРНК 8,9 и его последующее включение в белки. Когда экспрессия MetRS* регулируется клеточным промотором, неканоническая аминокислота будет включена в белки клеточным селективным образом. Как только ANL включается в белки, он может быть избирательно функционализирован с помощью химии кликов и впоследствии либо визуализирован с помощью визуализации (FUNCAT), либо с помощью Западного иммуноблота (BONCAT). Альтернативно, белки могут быть селективно очищены и идентифицированы с помощью масс-спектрометрии (МС). Используя эту технологию, мы создали линию мыши, экспрессирующую белок MetRS* под контролем рекомбиназы Cre. Учитывая растущее число доступных линий Cre-mouse, система MetRS* может быть использована в любой области для изучения любого типа клеток из любой ткани, для которой существует существующая Cre-line. Маркировка белка ANL возможна in vitro или in vivo и не изменяет поведение мыши или целостность белка6. Промежуток времени маркировки может быть адаптирован к научному вопросу каждого исследователя, маркируя вновь синтезированные белки (более короткое время маркировки) или целые протеомы (более длительное время маркировки). Использование этой методики ограничено количеством клеток того типа, которые исследователь желает изучить; следовательно, выделение белка из типов клеток с низким количеством или низкой скоростью метаболизма невозможно с помощью этого метода. Целью представленного способа является идентификация специфических для клеток белков/протеомов, меченных in vivo. В этом протоколе мы описываем, как маркировать специфические для клеток протеомы ANL у живых мышей и очищать меченые белки. После очистки белки могут быть идентифицированы с помощью обычных протоколов масс-спектрометрии 5,10. Снижение сложности образца, достигаемое этим методом путем селективной очистки белков из конкретных клеточных популяций, позволяет экспериментатору обнаруживать тонкие изменения в протеомах, например, в ответ на изменения окружающей среды. Очистка меченых белков может быть достигнута за ~ 10 дней, не включая анализ РС или период маркировки. Здесь мы описываем два способа введения ANL мышам, экспрессирующим MetRS*, а именно: (1) добавление аминокислоты в питьевую воду и (2) введение ANL путем внутрибрюшинных инъекций. Независимо от метода, выбранного для введения ANL, этапы выделения и очистки одинаковы (начиная с шага 2).
Protocol
Representative Results
Discussion
Важнейшими аспектами протокола являются: включение отрицательных контрольных групп, имеющих достаточное количество биологических реплик, путь введения ANL, количество и продолжительность, алкилирование образцов, концентрацию алкина и элиминацию β-меркаптоэтанола при использовании DS…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
B.A-C финансируется Министерством науки и инноваций Испании (Ramón y Cajal-RYC2018-024435-I), автономным сообществом Мадрида (Atracción de Talento-2019T1 /BMD-14057) и грантами MICINN (PID2020-113270RA-I00). R. A-P финансируется Автономным сообществом Мадрида (Atracción de Talento-2019T1/BMD-14057). E.M.S. финансируется Обществом Макса Планка, премией Advanced Investigator от Европейского исследовательского совета (грант 743216), DFG CRC 1080: Молекулярные и клеточные механизмы нейронного гомеостаза и DFG CRC 902: Молекулярные принципы регуляции на основе РНК. Мы благодарим Д.К. Дитериха и. Ландграфа за их технические рекомендации и синтез DST-Alkyne. Мы благодарим E. Northrup, S. Zeissler, S. Gil Mast и лабораторию для животных MPI for Brain Research за их отличную поддержку. Мы благодарим Сандру Геббельс за то, что она поделилась линейкой мышей Nex-Cre. Мы благодарим Антонио Г. Карроджо за помощь в редактировании английского языка. Б.А-К. разрабатывал, проводил и анализировал эксперименты. B.N-A, D.O.C, R.A-P, C.E. и S. t. Д. проводил и анализировал эксперименты. B.A-C и E.M.S. разрабатывали эксперименты и руководили проектом, B.A-C написал статью. Все авторы редактировали статью.
Materials
| 12% Acrylamide gels | GenScript | SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 12% | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M6250 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | 9830 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood |
| ANL | Synthesized as described previously for AHA (see references 5 and 11) | ||
| ANL-HCl | IrishBotech | HAA1625.0500 | |
| Benzonase | Sigma | E1014 | |
| Biotin alkyne | Thermo, | B10185 | |
| Chicken antibody anti-GFP | Aves | 1020 | |
| Complete EDTA-free protease inhibitor | Roche | 4693132001 | Toxic; use a lab coat and gloves. |
| Copper (I) bromide | Sigma | 254185 | 99.999% (wt/wt) |
| Disulfide tag (DST)-alkyne | Synthesized as reported in reference number 15, in which it is referred to as probe 20 | ||
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Filters | Merk | SCGP00525 | |
| Iodo acetamide (IAA) | Sigma | I1149 | |
| IR anti chicken 800 | LI-COR | IRDye 800CW | Donkey anti-Chicken Secondary Antibody |
| IR anti rabit 680 | LI-COR | IRDye 680RD | Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody |
| Maltose | Sigma | M9171 | |
| Manual Mixer | BioSpec Products | 1083 | |
| NaCl | Sigma | S9888 | |
| N-ethylmaleimide | Sigma | 4259 | Toxic; use a lab coat, gloves and a fume hood. |
| NeutrAvidin beads | Pierce | 29200 | |
| Nitrocellulose membrane | Bio-rad | 1620112 | |
| PBS 1X | Thermo | J62036.K2 | |
| PBS 1X pH 7.8 | Preparation described in reference number 5 | ||
| PD SpinTrap G-25 columns | GE Healthcare | Buffer exchange | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo, | 23225 | Reagents in the Pierce BCA Protein Assay Kit are toxic to aquatic life. |
| Polyclonal rabbit anti-biotin antibody | Cell Signaling | 5597 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| SDS 10% | Sigma | 71736 | |
| SDS-PAGE Running buffer MOPS | GenScript | M00138 | |
| SYPRO Ruby stain | Sigma | S4942 | |
| Table automatic Vortexer | Eppendorf | Mixmate | |
| Triazole ligand | Sigma | 678937 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Water | Sigma | W4502 | Molecular biology grade |
Riferimenti
- Alvarez-Castelao, B., Schuman, E. M. The regulation of synaptic protein turnover. Journal of Biological Chemistry. 290 (48), 28623-28630 (2015).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Dendritic protein synthesis, synaptic plasticity, and memory. Cell. 127 (1), 49-58 (2006).
- Dorrbaum, A. R., Alvarez-Castelao, B., Nassim-Assir, B., Langer, J. D., Schuman, E. M. Proteome dynamics during homeostatic scaling in cultured neurons. Elife. 9, 52939 (2020).
- Flexner, J. B., Flexner, L. B., Stellar, E. Memory in mice as affected by intracerebral puromycin. Science. 141 (3575), 57-59 (1963).
- Alvarez-Castelao, B., Schanzenbacher, C. T., Langer, J. D., Schuman, E. M. Cell-type-specific metabolic labeling, detection and identification of nascent proteomes in vivo. Nature Protocols. 14 (2), 556-575 (2019).
- Alvarez-Castelao, B., et al. Cell-type-specific metabolic labeling of nascent proteomes in vivo. Nature Biotechnology. 35 (12), 1196-1201 (2017).
- Ngo, J. T., et al. Cell-selective metabolic labeling of proteins. Nature Chemical Biology. 5 (10), 715-717 (2009).
- Mahdavi, A., et al. Engineered aminoacyl-tRNA synthetase for cell-selective analysis of mammalian protein synthesis. Journal of the American Chemical Society. 138 (13), 4278-4281 (2016).
- Yuet, K. P., et al. Cell-specific proteomic analysis in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (9), 2705-2710 (2015).
- Patel, V. J., et al. A comparison of labeling and label-free mass spectrometry-based proteomics approaches. Journal of Proteome Research. 8 (7), 3752-3759 (2009).
- Link, A. J., Vink, M. K., Tirrell, D. A. Preparation of the functionalizable methionine surrogate azidohomoalanine via copper-catalyzed diazo transfer. Nature Protocols. 2 (8), 1879-1883 (2007).
- Landgraf, P., Antileo, E. R., Schuman, E. M., Dieterich, D. C. BONCAT: Metabolic labeling, click chemistry, and affinity purification of newly synthesized proteomes. Methods in Molecular Biology. 1266, 199-215 (2015).
- Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Analysis of proteins by immunoblotting. Cold Spring Harbor Protocols. 2021 (12), (2021).
- Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10 (8), 730-736 (2013).
- Szychowski, J., et al. Cleavable biotin probes for labeling of biomolecules via azide-alkyne cycloaddition. Journal of the American Chemical Society. 132 (51), 18351-18360 (2010).
- Goebbels, S., et al. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44 (12), 611-621 (2006).
- van Geel, R., Pruijn, G. J., van Delft, F. L., Boelens, W. C. Preventing thiol-yne addition improves the specificity of strain-promoted azide-alkyne cycloaddition. Bioconjugate Chemistry. 23 (3), 392-398 (2012).
- O’Fagain, C. Lyophilization of proteins. Methods in Molecular Biology. 244, 309-321 (2004).
- Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
- Elinger, D., Gabashvili, A., Levin, Y. Suspension trapping (S-Trap) is compatible with typical protein extraction buffers and detergents for bottom-up proteomics. Journal of Proteome Research. 18 (3), 1441-1445 (2019).
- tom Dieck, S., et al. Direct visualization of newly synthesized target proteins in situ. Nature Methods. 12 (5), 411-414 (2015).
- McShane, E., et al. Kinetic analysis of protein stability reveals age-dependent degradation. Cell. 167 (3), 803-815 (2016).
- Calve, S., Witten, A. J., Ocken, A. R., Kinzer-Ursem, T. L. Incorporation of non-canonical amino acids into the developing murine proteome. Scientific Reports. 6, 32377 (2016).
- David, A., et al. Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation. Journal of Cell Biology. 197 (1), 45-57 (2012).
- Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis. Nature Methods. 6 (4), 275-277 (2009).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Burke, B., May, D. G. BioID: A screen for protein-protein interactions. Current Protocols in Protein Science. 91, 11-15 (2018).
