На месте Гибридизация в сочетании с иммуногистохимией в криосекционированных эмбрионах рыбок данио-рерио
Summary
В этом протоколе описывается, как получить изображения путем объединения гибридизации in situ и иммуногистохимии эмбриональных срезов рыбок данио. Гибридизация in situ проводилась перед криосекцией с последующим окрашиванием антителами. Полезно обнаружить паттерны экспрессии двух генов у рыбок данио, если антител не хватает.
Abstract
Как позвоночные, рыбки данио-рерио широко используются в биологических исследованиях. Рыбки данио-рерио и люди имеют высокую генетическую гомологию, что позволяет использовать его в качестве модели заболеваний человека. Исследование функции генов основано на обнаружении паттернов экспрессии генов. Хотя иммуногистохимия предлагает мощный способ анализа экспрессии белка, ограниченное количество коммерчески доступных антител у рыбок данио-рерио ограничивает применение окрашивания. Гибридизация in situ широко используется у эмбрионов рыбок данио-рерио для обнаружения экспрессии мРНК. В этом протоколе описывается, как получить изображения путем комбинирования гибридизации in situ и иммуногистохимии для срезов эмбрионов рыбок данио. Гибридизация in situ проводилась перед криосекцией с последующим окрашиванием антителами. Иммуногистохимия и визуализация одной криосекции были выполнены после гибридизации in situ . Протокол полезен для разгадки паттерна экспрессии двух генов, сначала путем обнаружения транскрипта in situ , а затем путем иммуногистохимии против белка в том же участке.
Introduction
Рыбки данио-рерио являются мощной моделью позвоночных для изучения развития и генетики 1,2. Рыбки данио-рерио и люди имеют высокую генетическую гомологию (70% генов являются общими с геномом человека), что позволяет использовать его в качестве модели для болезней человека3. У рыбок данио-рерио довольно часто обнаруживаются паттерны экспрессии двух генов и их пространственные отношения. Иммуногистохимия была впервые использована в 1941 году для обнаружения патогенов в инфицированных тканях путем применения антител, меченных FITC4. Белок-мишень в тканевом срезе сначала помечают первичным антителом, а затем срез помечают вторичным антителом против иммуноглобулина-хозяина первичного антитела. Окрашивание антител — это надежный подход к обнаружению локализации белков, который обеспечивает высокое оптическое разрешение на внутриклеточном уровне. Тем не менее, количество доступных антител очень ограничено у рыбок данио. Недавнее исследование показывает, что около 112 000 антител коммерчески доступны для мышей; Тем не менее, было продемонстрировано, что очень немногие антитела являются надежными у рыбокданио-рерио 5.
Вместо этого у рыбок данио-рерио гибридизация in situ широко применяется для анализа паттернов экспрессии генов. Этот метод был впервые использован для оценки экспрессии генов у эмбрионов дрозофилы в 1980-х годах6,7, и с тех пор эта технология постоянно развивалась и совершенствовалась. Первоначально для обнаружения транскриптов мРНК использовались ДНК-зонды с радиоактивной меткой; Однако пространственное разрешение было относительно низким, и существовали потенциальные риски для здоровья, вызванные радиоактивностью. Впоследствии гибридизация in situ опирается на РНК-зонды, меченные дигоксигенином (DIG) или флуоресцеином (Fluo), которые конъюгированы с щелочной фосфатазой (AP) или обнаруживаются с помощью флуоресцентного усиления тирамидного сигнала (TSA)8,9. Несмотря на то, что TSA используется для обнаружения двух или трех генов, маркировка DIG РНК-зондов и антиDIG-конъюгированные антитела AP по-прежнему являются высокочувствительными, стабильными и широко используемыми подходами для гибридизации in situ. Таким образом, коммерциализированные антитела в сочетании с DIG-меченными зондами in situ полезны для понимания локализации белка и экспрессии одного гена.
Цельные эмбрионы не могут выявить пространственную связь между генами из-за низкого оптического разрешения, даже несмотря на то, что эмбрионы рыбок данио-рерио маленькие и прозрачные10. Следовательно, секционирование необходимо для анализа паттернов экспрессии генов на внутриклеточном уровне. Криосекция широко используется у рыбок данио, поскольку она проста в выполнении и может эффективно сохранять антиген. Таким образом, гибридизация in situ в сочетании с иммуногистохимией в криосекциях рыбок данио-рерио предлагает мощный способ анализа паттернов экспрессии двух генов. Комбинация гибридизации in situ и иммуногистохимии была применена к рыбкам данио-рерио11. Однако лечение протеиназой К использовалось для усиления проникновения зонда за счет целостности антигена. Чтобы преодолеть это ограничение, этот протокол использует нагревание, чтобы вызвать извлечение антигена. Этот протокол применим не только к эмбрионам разных стадий и срезам тканей различной толщины (срезы головы 14 мкм и срезы спинного мозга 20 мкм), но также был проверен с использованием генов, экспрессируемых в двух органах, включая головной и спинной мозг.
В этой статье будет описано, как сочетать гибридизацию in situ и окрашивание антител у эмбрионов рыбок данио-рерио в криосекциях. Универсальность этого протокола демонстрируется с помощью ряда комбинаций гибридизации и иммуногистохимии in situ, включая зонды гибридизации in situ для двух разных нейронов. Этот метод подходит для обнаружения мРНК и белка в разных регионах и эмбрионах разного возраста, а также паттернов экспрессии двух генов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол предлагает комбинацию гибридизации in situ и иммуногистохимии, что является важным шагом в экспериментах по колокализации эмбрионов рыбок данио. Этот метод служит простым и эффективным способом одновременного анализа одной мРНК и одного белка. Гибридизацию in situ и…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Китайским научно-техническим фондом Наньтун (MS12019011), Китайским научно-техническим фондом Наньтун (JC2021058) и Фондом естественных наук высших учебных заведений провинции Цзянсу (21KJB180009).
Materials
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | Invitrogen | A21202 | |
| Anti-Digoxigenin AP Fab fragments | Roche | 11093274910 | |
| Anti-GFP antibody | Millipore | MAB3580 | |
| Blocking solution | made in lab | N/A | 0.1% Triton X-100, 3% BSA, 10% goat serum in 1x PBS |
| BM purple | Roche | 11442074001 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | B2064 | |
| CaCl2 | Sigma | C5670 | |
| Citrate buffer | Leagene | IH0305 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Cryomold for tissue, 15 mm x 15 mm x 5 mm | Head Biotechnology | H4566 | |
| DEPC-Treated Water | Sangon Biotech | B501005 | |
| Digital camera, fluorescence microscope | Nikon | NI-SSR 931479 | |
| E3 embryo medium | made in lab | N/A | 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2, 0.33 mM MgSO4 |
| Formamide | Invitrogen | AM9342 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin sodium salt | J&K Scientific | 542858 | |
| HYB | made in lab | N/A | preHYB plus 50 µg/mL heparin sodium salt, 100 µg/mL ribonucleic acid diethylaminoethanol salt |
| Immunohistochemical wet box | Mkbio | MH10002 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Low profile leica blades | Leica | 819 | |
| MABT (1x) | made in lab | N/A | 0.1 M maleic acid, 0.15 M NaCl, 0.02% Tween-20, pH 7.5 |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methanol | J&K Scientific | 116481 | |
| Methylene blue | Macklin | M859248 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| NTMT | made in lab | N/A | 0.1M Tris-HCl, 0.1M NaCl, 1% Tween-20 |
| OCT medium | Tissue-Tek | 4583 | |
| PAP pen | Enzo Life Sciences | ADI-950-233 | |
| Paraformaldehyde, 4% | Abbexa | abx082483 | made in lab in 1x PBS |
| PBST (1x) | made in lab | N/A | 1x PBS plus 0.1% Tween-20 |
| Phenylthiourea | Merck | 103-85-5 | |
| Phosphate-buffered saline (10x) | Invitrogen | AM9624 | |
| preHYB | made in lab | N/A | 50% formamide, 5x SSC, 9.2 mM citric acid (pH 6.0), 0.1% Tween-20 |
| Proteinase K | Roche | 1092766 | |
| Ribonucleic acid diethylaminoethanol salt | Sigma | R3629 | |
| RNase-free 1.5 mL tubes | Ambion | AM12400 | |
| SSC (20x) | Invitrogen | AM9770 | |
| SSCT (0.2x) | made in lab | N/A | 0.2x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| SSCT (1x) | made in lab | N/A | 1x SSC plus 0.1% Tween-20 |
| Sucrose | Invitrogen | 15503022 | |
| Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | |
| Zebrafish | Laboratory Animal Center of Nantong University | N/A |
Riferimenti
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Chen, E., Ekker, S. C. Zebrafish as a genomics research model. Current Pharmaceutical Biotechnology. 5 (5), 409-413 (2004).
- Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- The lack of commercial antibodies for model organisms (and how you can deal with it) [Internet]. BenchSci Blog Available from: https://blog.benchsci.com/the-lack-of-commercial-antibodies-for-model-organisms-and-how-you-can-deal-with-it (2018)
- Akam, M. E. The location of ultrabithorax transcripts in Drosophila tissue sections. EMBO Journal. 2, 2075-2084 (1983).
- Hafen, E., Levine, M., Garber, R. L., Gehring, W. J. An improved in situ hybridization method for the detection of cellular RNAs in Drosophila tissue sections and its application for localizing transcripts of the homeotic Antennapedia gene complex. EMBO Journal. 2, 617-623 (1983).
- Thisse, B., Thisse, C. In situ hybridization on whole-mount zebrafish embryos and young larvae. Methods in Molecular Biology. 1211, 53-67 (2014).
- Clay, H., Ramakrishnan, L. Multiplex fluorescent in situ hybridization in zebrafish embryos using tyramide signal amplification. Zebrafish. 2 (2), 105-111 (2005).
- Driever, W., Stemple, D., Schier, A., Solnica-Krezel, L. Zebrafish: genetic tools for studying vertebrate development. Trends in Genetics. 10 (5), 152-159 (1994).
- Cunningham, R. L., Monk, K. R. Whole mount in situ hybridization and immunohistochemistry for zebrafish larvae. Methods in Molecular Biology. 1739, 371-384 (2018).
- Thisse, C., Thisse, B. High-resolution in situ hybridization to whole-mount zebrafish embryos. Nature Protocols. 3 (1), 59-69 (2008).
- Heisler, L. K., Zhou, L., Bajwa, P., Hsu, J., Tecott, L. H. Serotonin 5-HT(2C) receptors regulate anxiety-like behavior. Genes, Brain, and Behavior. 6 (5), 491-496 (2007).
- Ferguson, J. L., Shive, H. R. Sequential immunofluorescence and immunohistochemistry on cryosectioned zebrafish embryos. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59344 (2019).
- Hammond-Weinberger, D. R., ZeRuth, G. T. Whole mount immunohistochemistry in zebrafish embryos and larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60575 (2020).
- Santos, D., Monteiro, S. M., Luzio, A. General whole-mount immunohistochemistry of zebrafish (Danio rerio) embryos and larvae protocol. Methods in Molecular Biology. 1797, 365-371 (2018).
- O’Hurley, G., Sjostedt, E., Rahman, A., Li, B., Kampf, C., Ponten, F., et al. Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Molecular Oncology. 8, 783-798 (2014).
