Tipo de fibra y análisis subcelular específico del contenido de gotas lipídicas en el músculo esquelético
Summary
La creciente evidencia indica que la infiltración excesiva de lípidos dentro del músculo esquelético resulta en lipotoxicidad y diabetes. Aquí, presentamos un protocolo completo, que incluye procesamiento de tejidos, tinción con Bodipy, adquisición de imágenes y análisis, para cuantificar el tamaño, la densidad y la distribución subcelular de las gotas lipídicas de una manera específica de tipo de fibra.
Abstract
La infiltración de lípidos del músculo esquelético, conocida como miosteatosis, aumenta con la obesidad y el envejecimiento. La miosteatosis también se ha descubierto recientemente como un factor de pronóstico negativo para varios otros trastornos como las enfermedades cardiovasculares y el cáncer. La infiltración excesiva de lípidos disminuye la masa muscular y la fuerza. También resulta en lipotoxicidad y resistencia a la insulina dependiendo del contenido total de lípidos intramiocelulares, la morfología de las gotas lipídicas (LD) y la distribución subcelular. El tipo de fibra (oxidativa vs glucolítica) también es importante, ya que las fibras oxidativas tienen una mayor capacidad para utilizar lípidos. Debido a sus implicaciones cruciales en la fisiopatología, se justifican estudios en profundidad sobre la dinámica y la función de la DA de una manera específica del tipo de fibra.
Aquí, se presenta un protocolo completo para la cuantificación del contenido de lípidos intramiocelulares y el análisis de la morfología de LD y la distribución subcelular de una manera específica del tipo de fibra. Con este fin, las criosecciones musculares en serie se tiñeron con el tinte fluorescente Bodipy y anticuerpos contra las isoformas de cadena pesada de miosina. Este protocolo permite el procesamiento simultáneo de diferentes músculos, ahorrando tiempo y evitando posibles artefactos y, gracias a una macro personalizada creada en Fiji, también es posible la automatización del análisis LD.
Introduction
La infiltración de lípidos del músculo esquelético, conocida como miosteatosis, aumenta con la obesidad y el envejecimiento. La miostetosis se correlaciona negativamente con la masa muscular y la fuerza y con la sensibilidad a la insulina1. Además, estudios recientes indican que el grado de miosteatosis podría usarse como factor pronóstico para otras afecciones como la enfermedad cardiovascular2, la enfermedad del hígado graso no alcohólico3 o el cáncer4. Los lípidos pueden acumularse en el músculo esquelético entre las fibras musculares como lípidos extramiocelulares o dentro de las fibras, como lípidos intramiocelulares (MMCL). Los MMCL se almacenan predominantemente como triglicéridos en gotas lipídicas (LD) que se utilizan como combustible metabólico durante el ejercicio físico 5,6. Sin embargo, cuando el suministro de lípidos excede la demanda, o cuando las mitocondrias se vuelven disfuncionales, las MMCL estarán implicadas en la resistencia muscular a la insulina, como se ve en individuos obesos metabólicamente insalubres y en pacientes con diabetes tipo 27. Curiosamente, los atletas de resistencia tienen niveles similares, si no más altos, de MMCL a los que se encuentran en pacientes obesos con diabetes mellitus tipo 2, mientras que mantienen una alta sensibilidad a la insulina. Este fenómeno se describe como la “paradoja del atleta”8,9, y se explica por una evaluación más matizada de los LD musculares, relacionados con su tamaño, densidad, localización, dinámica y composición de especies lipídicas.
En primer lugar, el tamaño de la DA está inversamente correlacionado con la sensibilidad a la insulina y la aptitud física10,11. De hecho, los LD más pequeños exhiben un área de superficie relativamente mayor para la acción de la lipasa y, por lo tanto, potencialmente tienen una mayor capacidad para movilizar lípidos12. En segundo lugar, la densidad de LD (número/superficie) juega un papel controvertido en la acción de la insulina 8,10; sin embargo, parece estar aumentado en los atletas. En tercer lugar, la localización subcelular de los LD es importante, ya que los LD situados justo debajo de la membrana superficial (subsarcolémmica o periférica) ejercen un efecto más perjudicial sobre la sensibilidad a la insulina que los centrales 8,9,13. Estos últimos proporcionan combustible a las mitocondrias centrales, que tienen una mayor actividad respiratoria y están más especializadas para satisfacer la alta demanda de energía requerida para la contracción14. Por el contrario, los LD periféricos suministran mitocondrias subsarcolemmales, que están involucradas en procesos relacionados con la membrana8. Finalmente, más allá de los triglicéridos, los lípidos complejos específicos dentro del músculo pueden ser más perjudiciales que otros. Por ejemplo, el diacilglicerol, el acil-CoA de cadena larga y las ceramidas pueden acumularse en el músculo cuando la tasa de renovación de triglicéridos es baja, lo que afecta la señalización de la insulina 9,15. Volviendo a la “paradoja del atleta”, los atletas de resistencia tienen un alto número de LD centrales más pequeños con tasas de rotación elevadas en fibras tipo I (oxidativas), mientras que los pacientes obesos y diabéticos tienen LD periféricos más grandes con bajas tasas de renovación en fibras tipo II (glucolíticas) 8,15,16. Además de su papel en el almacenamiento y liberación de energía, los LD a través de ácidos grasos derivados (FA) y una proteína de capa (perilipina 5) también podrían funcionar como actores críticos involucrados en la regulación transcripcional de la oxidación de FA y la biogénesis mitocondrial8. Debido a sus implicaciones cruciales en fisiología y fisiopatología, se justifican estudios en profundidad sobre la dinámica y las funciones de los LD.
Aunque existen varias técnicas para estudiar las IGMCL, no todas son adecuadas para cuantificar con precisión el tamaño, la densidad y la distribución de la LD de una manera específica de la fibra. Por ejemplo, la evaluación de los MMCL por espectroscopia de resonancia magnética, si bien no es invasiva, ofrece un nivel de resolución que no es suficiente para estudiar el tamaño y la ubicación precisa de los LD dentro de la fibra, y no es específico del tipo de fibra17,18. Del mismo modo, las técnicas bioquímicas realizadas en homogeneizados de músculo entero19 no pueden evaluar la ubicación y el tamaño de los lípidos. En consecuencia, el método más adecuado para analizar la morfología y la ubicación de la DA es la microscopía electrónica de transmisión cuantitativa13, pero esta técnica es costosa y requiere mucho tiempo. Por lo tanto, la imagen de fluorescencia confocal en preparaciones con colorantes como Oil Red O (ORO)20,21, monodansilipentano (MDH)22 o Bodipy 23,24,25, se ha convertido en la mejor herramienta para estos estudios.
Aquí, se describe un protocolo completo, que incluye muestreo y procesamiento de tejidos, tinción de Bodipy y adquisición y análisis de imágenes confocales para cuantificar el tamaño, el número y la localización de LD en criosecciones musculares de ratón. Dado que los MMCL no están distribuidos uniformemente entre las fibras oxidativas y glucolíticas, y cada tipo de fibra regula la dinámica de la LD de manera diferente, el estudio de los MMCL debe ser específico del tipo de fibra 16,25,26,27. Por lo tanto, este protocolo utiliza inmunofluorescencia en secciones seriadas para identificar las isoformas de cadena pesada de miosina (MyHC) expresadas por cada fibra. Otra ventaja de este protocolo es el procesamiento simultáneo de un músculo glicolítico (extensor digitorum longus, EDL) y oxidativo (sóleo) colocados uno al lado del otro antes de la congelación (Figura 1). Este procesamiento simultáneo no solo ahorra tiempo, sino que también evita la variabilidad debido al procesamiento separado de las muestras.
Figura 1: Descripción general esquemática del procedimiento. Después de la disección muscular (1), los músculos seleccionados de tamaño similar se preparan y congelan juntos (2). Las secciones transversales en serie de 10 μm se obtienen mediante un criostato y se montan directamente en portaobjetos de adhesión (3). A partir de dos diapositivas seriadas, la primera (4A) está inmunomarcada para laminina y teñida con Bodipy para reconocer las LD y la segunda (4B) está inmunoteñida con anticuerpos contra MyHCs para el reconocimiento de tipos de fibras musculares. Las imágenes se adquieren utilizando un microscopio confocal para Bodipy (5A) y un microscopio de epifluorescencia para tipos de fibras musculares (5B). Las imágenes se analizan en Fiji aplicando un umbral y cuantificando partículas (6A) para obtener el número, tamaño medio, densidad y porcentaje del área total ocupada por LD (7) o celdas de conteo (6B) para obtener el porcentaje de fibras de cada tipo en la sección (7). Abreviaturas: LD = gotas lipídicas; EDL = extensor digitorum longus; MyHCs = isoformas de cadena pesada de miosina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo detallado aquí describe un método eficiente para cuantificar los LD etiquetados con Bodipy sobre una base específica de tipo de fibra y subcelular. En los últimos años, los colorantes lipídicos clásicos, como ORO o Sudan Black B, han sido sustituidos por una nueva gama de colorantes fluorescentes, lipofílicos y permeables a las células que se unen a lípidos neutros (por ejemplo, Bodipy). Disponible como diferentes conjugados, Bodipy ha demostrado ser muy eficaz en el etiquetado de LD para estudiar …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS-Crédit de Recherche J.0022.20) y la Société Francophone du Diabète (SFD-Roche Diabetes Care).C.M.S. es el receptor de una beca de doctorado de la FRIA (FNRS). M.A.D.-L.d.C. recibió una beca del Programa de Excelencia Internacional Wallonie-Bruxelles.
Los autores agradecen a Alice Monnier por su contribución al desarrollo de este protocolo y a Caroline Bouzin por su experiencia y ayuda técnica en el proceso de adquisición de imágenes. También agradecemos a la plataforma de imágenes 2IP-IREC por el acceso al criostato y los microscopios (2IP-IREC Imaging Platform, Institute of Experimental and Clinical Research, Université Catholique de Louvain, 1200 Bruselas, Bélgica). Finalmente, los autores desean agradecer a Nicolas Dubuisson, Romain Versele y Michel Abou-Samra por la crítica constructiva del manuscrito. Algunas de las figuras de estos artículos fueron creadas con BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| AxioCam 506 mono 6 Mpix camera | Zeiss | ||
| AxioCam MRm 1.4MPix CCD camera | Zeiss | ||
| Chemical hood | Potteau Labo | EN-14175 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM800 | |
| Cork discs (ø 20 mm, 3 mm thick) | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Cryo-Gloves | Tempshield | 16072252 | |
| Cryostat | Thermo Scientific | Microm Cryo Star HM 560 | |
| Dissecting Stereo Microscope SMZ745 | Nikon | ||
| Dry Ice | |||
| Dumont Forceps | F.S.T | 11295-10 | |
| Epifluorescence microscope | Zeiss | AxioImage-Apotome Z1 | |
| Extra Fine Bonn Scissors | F.S.T | 14084-08 | |
| FisherBrand Disposable Base Molds (0.7 x 0.7 cm) | ThermoFisher | 22-363-552 | Used to cut a piece to hold the muscle on the cork for freezing |
| Glass petri dish (H 25 mm, ø 150 mm) | BRAND Petri dish, MERK | BR455751 | Used to place the muscles on ice during dissection |
| ImmEdge Hydrophobic barrier PAP Pen | Vector Labs | H-4000 | Used to create an hidrophobic barrier around the muscle sections |
| Incubator | MMM Medcenter | Incucell 707 | |
| Microscope Cover Glasses (24×50 mm) | Assistent | 40990151 | |
| Microscope Slide Boxes | Kartell | 278 | Used as humid chambers for immunohistochemistry |
| Neck holder | Linie zwo | SB-035X-02 | Used as strap to hold the stainless steel tumbler |
| No 15 Sterile Carbon Steel Scalpel Blade | Swann-Morton | 0205 | |
| Paint brushes | Van Bleiswijck | Amazon B07W7KJQ2X | Used to handle cryosections |
| Permanent Marker Pen Black | Klinipath/VWR | 98307-R | Used to label slides |
| Pierce Fixation Forceps | F.S.T | 18155-13 | |
| Polystyrene Box | H 12 cm x L 25 cm x W 18 cm, used as a liquid nitrogen container and to transport the samples to the cryostat | ||
| Scalpel Handle, 125 mm (5"), No. 3 | Aesculap | BB073R | |
| Stainless Steel Cup 10oz | Eboxer | B07GFCBPFH | Tumbler to fill with isopentene for muscle freezing |
| Superfrost Ultra Plus slides | ThermoFisher | J1800AMNZ | |
| Surgical tweezers 1/2 teeth | Medische Vakhandel | 1303152 | Also called "Rat teeth tweezers" |
| Vannas Spring Scissors – 3 mm Cutting Edge | F.S.T | 15000-00 | |
| Weighing boats | VWR international | 611-2249 | |
| Whole-Slide Scanner for Fluorescence | Zeiss | Axio Scan.Z1 | |
| Reagents | |||
| Alexa Fluor 405 Goat Anti-Mouse IgG2b | Sigma-Aldrich | SAB4600477 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG1 | ThermoFisher | A-21121 | Used at a final concentration of 1:500 |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Mouse IgM | Abcam | ab175702 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Alexa Fluor 647 goat anti rat-IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher | A-21247 | Used at a final concentration of 1:500 |
| BODIPY-493/503 (4,4-difluoro-1,3,5,7,8-pentametil-4-bora-3a,4a-diaza-s-indaceno) | ThermoFisher | D3922 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| BODIPY-558/568 C12 (4,4-Difluoro-5-(2-Thienyl)-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) | ThermoFisher | D3835 | Used at a final concentration of 1 µg/mL |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | ThermoFisher | D1306 | Used at a final concentration of 0.5 µg/mL |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D-8418 | Used to solve Bodipy for the 1 mg/mL stock solution. CAUTION: Toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 1004969011 | CAUTION: May cause an allergic skin reaction. Suspected of causing genetic defects. May cause cancer. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles. |
| Isopentane GPR RectaPur | VWR international | 24872.298 | CAUTION: Extremely flammable liquid and vapor. May be fatal if swallowed and enters airways. May cause drowsiness or dizziness. Repeated exposure may cause skin dryness or cracking. Wear protective gloves/protective clothing/eye protection/face protection. |
| Liquid Nitrogen | CAUTION: Extremely cold. Wear gloves. Handle slowly to minimize boiling and splashing and in well ventilated areas. Use containers designed for low-temperature liquids. | ||
| Mouse on mouse Blocking Reagent | Vector Labs | MKB-2213-1 | Used at concentration of 1:30 |
| Myosin heavy chain Type I (BA-D5-s Primary Antibody) Gene: MYH7, monoclonal bovine anti mouse IgG2b | DSHB University of Iowa | BA-D5-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIA (SC-71-s Primary Antibody) Gene: MYH2, Monoclonal bovine anti mouse IgG1 | DSHB University of Iowa | SC-71-supernatant | Used at a final concentration of 1:10 |
| Myosin heavy chain Type IIX (6H1-s Primary Antibody), Gene: MYH1, Monoclonal rabbit anti mouse IgM | Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa | 6H1-supernatant | Used at a final concentration of 1:5 |
| Normal Goat Serum (NGS) | Vector Labs | S-1000 | |
| PBS 0.1 M | Commonly used on histology laboratories | ||
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P36930 | |
| Rat anti-Laminin-2 (α-2 Chain) primary antibody (monoclonal) | Sigma-Aldrich | L0663 | Used at a final concentration of 1:1,000 |
| Tissue-Tek O.C.T compound | Sakura | 4583 | |
| Software | |||
| Adobe Illustrator CC | Adobe Inc. | Used to design the figures | |
| Adobe Photoshop | Adobe Inc. | Confocal software | |
| BioRender | https://biorender.com/ | Used to design the figures | |
| Fiji/ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/ | Used to analyse the acquired images | |
| Microsoft PowerPoint | Microsoft | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types | |
| Zen Blue 2.6 | Zeiss | Used to reconstruct the histology of the whole muscle after scanning the fiber types |
Riferimenti
- Correa-de-Araujo, R., et al. Myosteatosis in the context of skeletal muscle function deficit: an interdisciplinary workshop at the National Institute on Aging. Frontiers in Physiology. 11, 963 (2020).
- Miljkovic, I., et al. Greater skeletal muscle fat infiltration is associated with higher all-cause and cardiovascular mortality in older men. Journals of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (9), 1133-1140 (2015).
- Nachit, M., et al. Myosteatosis rather than sarcopenia associates with non-alcoholic steatohepatitis in non-alcoholic fatty liver disease preclinical models. Journal of Cachexia, Sarcopenia, and Muscle. 12 (1), 144-158 (2021).
- Aleixo, G. F. P., et al. Myosteatosis and prognosis in cancer: Systematic review and meta-analysis. Critical Reviews in Oncology/Hematolgoy. 145, 102839 (2020).
- Gemmink, A., Schrauwen, P., Hesselink, M. K. C. Exercising your fat (metabolism) into shape: a muscle-centred view. Diabetologia. 63 (8), 1453-1463 (2020).
- van Loon, L. J. Use of intramuscular triacylglycerol as a substrate source during exercise in humans. Journal of Applied Physiology. 97 (4), 1170-1187 (2004).
- Coen, P. M., Goodpaster, B. H. Role of intramyocelluar lipids in human health. Trends in Endocrinology and Metabolism. 23 (8), 391-398 (2012).
- Seibert, J. T., Najt, C. P., Heden, T. D., Mashek, D. G., Chow, L. S. Muscle lipid droplets: cellular signaling to exercise physiology and beyond. Trends in Endocrinology and Metabolism. 31 (12), 928-938 (2020).
- Bergman, B. C., Goodpaster, B. H. Exercise and muscle lipid content, composition, and localization: influence on muscle insulin sensitivity. Diabetes. 69 (5), 848-858 (2020).
- Nielsen, J., Christensen, A. E., Nellemann, B., Christensen, B. Lipid droplet size and location in human skeletal muscle fibers are associated with insulin sensitivity. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 313 (6), 721-730 (2017).
- Covington, J. D., et al. Intramyocellular lipid droplet size rather than total lipid content is related to insulin sensitivity after 8 weeks of overfeeding. Obesity (Silver Spring). 25 (12), 2079-2087 (2017).
- Bosma, M. Lipid droplet dynamics in skeletal muscle). Experimental Cell Research. 340 (2), 180-186 (2016).
- Nielsen, J., et al. Increased subsarcolemmal lipids in type 2 diabetes: effect of training on localization of lipids, mitochondria, and glycogen in sedentary human skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 298 (3), 706-713 (2010).
- Ferreira, R., et al. Subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria proteome differences disclose functional specializations in skeletal muscle. Proteomics. 10 (17), 3142-3154 (2010).
- Barrett, J. S., Whytock, K. L., Strauss, J. A., Wagenmakers, A. J. M., Shepherd, S. O. High intramuscular triglyceride turnover rates and the link to insulin sensitivity: influence of obesity, type 2 diabetes and physical activity. Applied Physiology, Nutrition and Metabolism. , 1-14 (2022).
- Daemen, S., et al. Distinct lipid droplet characteristics and distribution unmask the apparent contradiction of the athlete’s paradox. Molecular Metabolism. 17, 71-81 (2018).
- Bredella, M. A., Ghomi, R. H., Thomas, B. J., Miller, K. K., Torriani, M. Comparison of 3.0 T proton magnetic resonance spectroscopy short and long echo-time measures of intramyocellular lipids in obese and normal-weight women. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 32 (2), 388-393 (2010).
- Schrauwen-Hinderling, V. B., Hesselink, M. K., Schrauwen, P., Kooi, M. E. Intramyocellular lipid content in human skeletal muscle. Obesity (Silver Spring). 14 (3), 357-367 (2006).
- De Bock, K., et al. Evaluation of intramyocellular lipid breakdown during exercise by biochemical assay, NMR spectroscopy, and Oil Red O staining. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 293 (1), 428-434 (2007).
- Koopman, R., Schaart, G., Hesselink, M. K. Optimisation of oil red O staining permits combination with immunofluorescence and automated quantification of lipids. Histochemistry and Cell Biology. 116 (1), 63-68 (2001).
- Gueugneau, M., et al. Skeletal muscle lipid content and oxidative activity in relation to muscle fiber type in aging and metabolic syndrome. Journal of Gerontology Series A: Biomedical Sciences and Medical Sciences. 70 (5), 566-576 (2015).
- Gemmink, A., et al. Super-resolution microscopy localizes perilipin 5 at lipid droplet-mitochondria interaction sites and at lipid droplets juxtaposing to perilipin 2. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1863 (11), 1423-1432 (2018).
- Spangenburg, E. E., Pratt, S. J. P., Wohlers, L. M., Lovering, R. M. Use of BODIPY (493/503) to visualize intramuscular lipid droplets in skeletal muscle. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 598358, (2011).
- Prats, C., et al. An optimized histochemical method to assess skeletal muscle glycogen and lipid stores reveals two metabolically distinct populations of type I muscle fibers. PLoS One. 8 (10), 77774 (2013).
- Strauss, J. A., Shepherd, D. A., Macey, M., Jevons, E. F. P., Shepherd, S. O. Divergence exists in the subcellular distribution of intramuscular triglyceride in human skeletal muscle dependent on the choice of lipid dye. Histochemistry and Cell Biology. 154 (4), 369-382 (2020).
- Shepherd, S. O., et al. Sprint interval and traditional endurance training increase net intramuscular triglyceride breakdown and expression of perilipin 2 and 5. Journal of Physiology. 591 (3), 657-675 (2013).
- Whytock, K. L., et al. A 7-day high-fat, high-calorie diet induces fibre-specific increases in intramuscular triglyceride and perilipin protein expression in human skeletal muscle. Journal of Physiology. 598 (6), 1151-1167 (2020).
- Wang, C., Yue, F., Kuang, S. Muscle histology characterization using h&e staining and muscle fiber type classification using immunofluorescence staining. Bio-Protocol. 7 (10), (2017).
- Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51586 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (99), e52793 (2015).
- Leiva-Cepas, F., et al. Laboratory methodology for the histological study of skeletal muscle. Archivos de Medicina del Deporte. 35 (186), 254-262 (2018).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 10 (3), 197-205 (1989).
- Komiya, Y., et al. Mouse soleus (slow) muscle shows greater intramyocellular lipid droplet accumulation than EDL (fast) muscle: fiber type-specific analysis. Journal of Muscle Research & Cell Motility. 38 (2), 163-173 (2017).
- Andrich, D. E., et al. Altered lipid metabolism impairs skeletal muscle force in young rats submitted to a short-term high-fat diet. Frontiers in Physiology. 9, 1327 (2018).
- Schiaffino, S. Fibre types in skeletal muscle: a personal account. Acta Physiologica. 199 (4), 451-463 (2010).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), 35273 (2012).
- Gemmink, A., et al. Decoration of intramyocellular lipid droplets with PLIN5 modulates fasting-induced insulin resistance and lipotoxicity in humans. Diabetologia. 59 (5), 1040-1048 (2016).
- Askinas, C., et al. . Biophotonics Congress: Biomedical Optics Congress 2018 (Microscopy/Translational/Brain/OTS). , (2018).
- Morén, B., et al. EHD2 regulates adipocyte function and is enriched at cell surface-associated lipid droplets in primary human adipocytes. Molecular Biology of the Cell. 30 (10), 1147-1159 (2019).
- Benador, I. Y., et al. Mitochondria bound to lipid droplets have unique bioenergetics, composition, and dynamics that support lipid droplet expansion. Cell Metabolism. 27 (4), 869-885 (2018).
- de la Rosa Rodriguez, M. A., et al. Hypoxia-inducible lipid droplet-associated induces DGAT1 and promotes lipid storage in hepatocytes. Molecular Metabolism. 47, 101168 (2021).
- Jevons, E. F. P., Gejl, K. D., Strauss, J. A., Ørtenblad, N., Shepherd, S. O. Skeletal muscle lipid droplets are resynthesized before being coated with perilipin proteins following prolonged exercise in elite male triathletes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 318 (3), 357-370 (2020).
- Ohsaki, Y., Maeda, T., Fujimoto, T. Fixation and permeabilization protocol is critical for the immunolabeling of lipid droplet proteins. Histochemistry and Cell Biology. 124 (5), 445-452 (2005).
- Prats, C., et al. Decrease in intramuscular lipid droplets and translocation of HSL in response to muscle contraction and epinephrine. Journal of Lipid Research. 47 (11), 2392-2399 (2006).
- Listenberger, L. L., Brown, D. A. Fluorescent detection of lipid droplets and associated proteins. Current Protocols in Cell Biology. , (2007).
- Xue, Y., Lim, S., Bråkenhielm, E., Cao, Y. Adipose angiogenesis: quantitative methods to study microvessel growth, regression and remodeling in vivo. Nature Protocols. 5 (5), 912-920 (2010).
- Muliyil, S., et al. ADAM17-triggered TNF signalling protects the ageing Drosophila retina from lipid droplet-mediated degeneration. The EMBO Journal. 39 (17), 104415 (2020).
- Yan, Q., et al. Autophagy activation contributes to lipid accumulation in tubular epithelial cells during kidney fibrosis. Cell Death Discovery. 4, 2 (2018).
- Coassin, S., et al. Investigation and functional characterization of rare genetic variants in the adipose triglyceride lipase in a large healthy working population. PLoS Genetics. 6 (12), 1001239 (2010).
- Daemen, S., van Zandvoort, M., Parekh, S. H., Hesselink, M. K. C. Microscopy tools for the investigation of intracellular lipid storage and dynamics. Molecular Metabolism. 5 (3), 153-163 (2016).
- Chen, Q., et al. Rab8a deficiency in skeletal muscle causes hyperlipidemia and hepatosteatosis by impairing muscle lipid uptake and storage. Diabetes. 66 (9), 2387-2399 (2017).
- Gemmink, A., et al. Decoration of myocellular lipid droplets with perilipins as a marker for in vivo lipid droplet dynamics: A super-resolution microscopy study in trained athletes and insulin resistant individuals. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular and Cell Biology of Lipids. 1866 (2), 158852 (2021).
- Bergman, B. C., Hunerdosse, D. M., Kerege, A., Playdon, M. C., Perreault, L. Localisation and composition of skeletal muscle diacylglycerol predicts insulin resistance in humans. Diabetologia. 55 (4), 1140-1150 (2012).
