Combinaison d’organoïdes humains et de la technologie Organ-on-a-Chip pour modéliser des fonctionnalités spécifiques à la région intestinale
Summary
Les organoïdes intestinaux dérivés de la biopsie et les technologies d’organes sur puce sont combinés dans une plate-forme microphysiologique pour récapituler la fonctionnalité intestinale spécifique à la région.
Abstract
La muqueuse intestinale est une barrière physique et biochimique complexe qui remplit une myriade de fonctions importantes. Il permet le transport, l’absorption et le métabolisme des nutriments et des xénobiotiques tout en facilitant une relation symbiotique avec le microbiote et en limitant l’invasion des micro-organismes. L’interaction fonctionnelle entre les différents types de cellules et leur environnement physique et biochimique est vitale pour établir et maintenir l’homéostasie des tissus intestinaux. La modélisation de ces interactions complexes et de la physiologie intestinale intégrée in vitro est un objectif formidable avec le potentiel de transformer la façon dont de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouveaux candidats médicaments sont découverts et développés.
Les technologies Organoïdes et Organ-on-a-Chip ont récemment été combinées pour générer des puces intestinales pertinentes pour l’homme adaptées à l’étude des aspects fonctionnels de la physiologie intestinale et de la physiopathologie in vitro. Les organoïdes dérivés des biopsies du petit (duodénum) et du gros intestin sont ensemencés dans le compartiment supérieur d’une puce d’organe, puis se développent avec succès en monocouches tout en préservant les caractéristiques cellulaires, moléculaires et fonctionnelles distinctes de chaque région intestinale. Les cellules endothéliales microvasculaires spécifiques du tissu intestinal humain sont incorporées dans le compartiment inférieur de la puce de l’organe pour recréer l’interface épithéliale-endothéliale. Cette nouvelle plate-forme facilite l’exposition luminale aux nutriments, aux médicaments et aux micro-organismes, permettant des études sur le transport intestinal, la perméabilité et les interactions hôte-microbe.
Ici, un protocole détaillé est fourni pour l’établissement de puces intestinales représentant le duodénum humain (puce du duodénum) et le côlon (puce du côlon), et leur culture ultérieure sous des déformations continues et de type péristaltisme. Nous démontrons des méthodes d’évaluation du métabolisme des médicaments et de l’induction du CYP3A4 dans la puce du duodénum à l’aide d’inducteurs et de substrats prototypiques. Enfin, nous fournissons une procédure étape par étape pour la modélisation in vitro de la perturbation de la barrière médiée par l’interféron gamma (IFNγ) (syndrome de l’intestin perméable) dans une puce du côlon, y compris des méthodes d’évaluation de l’altération de la perméabilité paracellulaire, des changements dans la sécrétion de cytokines et du profilage transcriptomique des cellules de la puce.
Introduction
L’intestin humain est un organe complexe et multitâche capable de s’auto-régénérer. Il est divisé en petit et gros intestin. La fonction principale de l’intestin grêle est de digérer davantage les aliments provenant de l’estomac, d’absorber tous les nutriments et de transmettre les résidus au gros intestin, qui récupère l’eau et les électrolytes. L’intestin grêle est en outre divisé en plusieurs régions anatomiquement distinctes: le duodénum, le jéjunum et l’iléon, chacune étant adaptée pour remplir des fonctions spécifiques. Par exemple, le duodénum aide à décomposer le chyme (contenu de l’estomac) pour permettre la bonne absorption des nutriments impliquant des protéines, des glucides, des vitamines et des minéraux dans le jéjunum. Cette partie proximale de l’intestin grêle est également le principal site d’absorption et de métabolisme des médicaments intestinaux, et elle se caractérise par l’expression plus élevée des enzymes métabolisant les médicaments (par exemple, le CYP3A4) par rapport à leur expression dans l’iléon et le côlon1. En plus de son rôle principal dans la digestion et l’absorption des nutriments, l’intestin est également une barrière efficace contre les contenus luminaux potentiellement nocifs, tels que les micro-organismes pathogènes, les métabolites microbiens, les antigènes alimentaires et les toxines 2,3. Il est à noter que le côlon humain est habité par un grand nombre de micro-organismes, dépassant de loin celui des cellules totales du corps humain, qui offrent de nombreux avantages pour la nutrition, le métabolisme et l’immunité. Par conséquent, le maintien de l’intégrité de la barrière muqueuse formée par les cellules épithéliales intestinales est essentiel pour permettre la relation symbiotique entre le microbiote intestinal et les cellules hôtes en les séparant physiquement afin d’éviter une activation inutile des cellules immunitaires2. En outre, la mort cellulaire intestinale programmée joue un rôle essentiel en tant que mécanisme d’autoprotection empêchant les cellules infectées de persister ou de proliférer – disséminant ainsi des agents pathogènes potentiels3 – tandis que l’auto-renouvellement continu de l’épithélium intestinal tous les quatre à sept jours compense la perte cellulaire assurant l’intégrité de la barrière et l’homéostasie tissulaire. Les déficiences des fonctions intestinales décrites, y compris l’absorption des nutriments, l’intégrité de la barrière ou le déséquilibre dans la mort et l’auto-renouvellement des cellules intestinales, peuvent entraîner le développement d’une gamme de troubles gastro-intestinaux, y compris la malnutrition et les maladies inflammatoires de l’intestin (MII)2,3.
Auparavant, des modèles animaux et des lignées cellulaires intestinales transformées dérivées du cancer ont été utilisés pour étudier les fonctions physiologiques et physiopathologiques du tissu intestinal humain. Cependant, les préoccupations de plus en plus importantes concernant la transférabilité de la recherche animale à l’homme, causées par la présence de disparités importantes entre les deux espèces, ont mis en évidence la nécessité de méthodes alternatives pertinentes pour l’homme4. Les lignées cellulaires intestinales in vitro couramment utilisées comprennent les cellules T84, Caco-2 et HT29. Bien qu’ils imitent certains aspects de la fonction de barrière intestinale et du transport membranaire, ils se caractérisent par une expression altérée des enzymes métabolisant les médicaments5, des récepteurs de surface et des transporteurs4. De plus, ils manquent de spécificité du segment intestinal et ne parviennent pas à récapituler la complexité de l’épithélium intestinal, chaque modèle ne contenant qu’un seul des cinq types de cellules épithéliales présentes dans l’intestin6.
Récemment, des cultures organoïdes intestinales humaines établies à partir de biopsies fraîches de l’intestin grêle et du côlon 7,8 ou de cellules souches pluripotentes induites (CSPi)9 ont été introduites comme modèles expérimentaux alternatifs ayant le potentiel de compléter, de réduire et peut-être de remplacer l’expérimentation animale à l’avenir. Bien que les CSPi puissent être obtenues de manière non invasive, l’établissement d’organoïdes à partir de CSPi nécessite l’utilisation de protocoles complexes et longs (avec plusieurs étapes expérimentales) et génère des cultures ressemblant à du tissu fœtal humain. En revanche, les organoïdes dérivés de la biopsie sont hautement évolutifs, car ils peuvent tirer parti de la capacité de renouvellement inhérente du tissu intestinal et peuvent être indéfiniment passés et propagés in vitro. Il est important de noter que les organoïdes dérivés de la biopsie maintiennent les caractéristiques spécifiques de la maladie et de la région intestinale du tissu primaire à partir duquel ils ont été développés et émulent la diversité cellulaire de l’épithélium intestinal. Les organoïdes peuvent être utilisés comme avatars spécifiques au patient in vitro pour démêler la biologie et la pathogenèse de divers troubles gastro-intestinaux et améliorer leur gestion thérapeutique. Bien que les organoïdes intestinaux aient atteint un degré impressionnant de fonctionnalité physiologique, ils ne parviennent toujours pas à reproduire la complexité des organes natifs en raison de leur manque de composants stromaux critiques – y compris les vaisseaux sanguins, le tissu conjonctif, les nerfs périphériques et les cellules immunitaires – ainsi que de stimulation mécanique. Les paramètres mécaniques, tels que l’écoulement, la contrainte de cisaillement, l’étirement et la pression, sont connus pour influencer la morphogenèse tissulaire et l’homéostasie in vivo et il a déjà été démontré qu’ils amélioraient la maturation des cellules in vitro10,11,12,13. Un autre inconvénient important des systèmes organoïdes est l’inaccessibilité de la lumière et, par conséquent, du côté apical de l’épithélium. Cela représente un défi pour l’étude de divers mécanismes associés à l’expression polarisée des transporteurs d’ions et de médicaments, aux interactions hôte-microbiome et aux tests de toxicité pharmaceutique. Enfin, les cultures organoïdes souffrent d’une variabilité considérable de taille, de morphologie et de fonction, en raison de la nature stochastique du processus d’auto-organisation in vitro et des choix de destin cellulaire. Par conséquent, pour réaliser le plein potentiel des organoïdes intestinaux dans la modélisation des maladies, le dépistage des médicaments et la médecine régénérative, il est nécessaire d’explorer de nouvelles stratégies qui réduisent la variabilité du développement organoïde, améliorent l’accès au compartiment luminal et intègrent les interactions cellule-cellule manquantes.
La technologie Organ-on-a-Chip a introduit de nombreuses techniques pour l’incorporation de forces mécaniques et d’écoulement de fluide dans les cultures de cellules intestinales in vitro. Cependant, étant donné que la plupart des études initiales de preuve de concept ont utilisé des lignées cellulaires dérivées du cancer qui ne présentaient pas une diversité cellulaire suffisante, la pertinence de ces systèmes a été remise en question. Récemment, nous avons combiné de manière synergique des organoïdes intestinaux et la technologie organ-on-a-chip pour incorporer les meilleures caractéristiques de chaque approche dans un système in vitro 14,15,16. La puce intestinale résultante récapitule l’architecture multicellulaire de l’épithélium intestinal, la présence d’une interface tissulaire épithéliale-endothéliale et les forces mécaniques de l’écoulement et de l’étirement des fluides, permettant l’émulation des fonctions au niveau des organes in vitro. De plus, l’utilisation d’organoïdes dérivés de tissus primaires (qui peuvent être échantillonnés dans différentes régions de l’intestin humain) comme matériau de départ augmente la polyvalence de ce modèle, car des puces représentant le duodénum, le jéjunum, l’iléon et le côlon humains peuvent être établies à la suite de procédures d’ensemencement et de culture similaires. Il est important de noter que les puces intestinales permettent d’évaluer en temps réel: l’intégrité de la barrière intestinale; activité de la bordure de la brosse et des enzymes du métabolisme des médicaments; production de mucines; sécrétion de cytokines; et l’interaction des cellules intestinales avec des micro-organismes pathogènes et commensaux, comme le démontrent les rapports publiés précédemment. Notamment, lorsque les puces intestinales ont été établies à l’aide d’organoïdes générés à partir de tissus de différents individus, ces modèles ont capturé la variabilité attendue entre donneurs dans les réponses fonctionnelles à divers médicaments et traitements. Dans l’ensemble, la fusion des organoïdes avec la technologie Organ-on-a-Chip ouvre la porte à des modèles plus avancés, personnalisés et pertinents in vivo qui pourraient améliorer la pertinence physiologique et la précision des résultats in vitro ainsi que leur extrapolation aux humains. Ici, un protocole détaillé est présenté pour établir la puce intestinale et son application dans les études des fonctions physiologiques des deux segments intestinaux: duodénum et côlon. Tout d’abord, les méthodes d’évaluation de l’activité de l’enzyme métabolisant le médicament CYP3A4 dans la puce du duodénum, ainsi que son induction par des composés prototypiques tels que la rifampicine et la vitamine D3, sont décrites. Deuxièmement, les étapes nécessaires pour modéliser « l’intestin qui fuit » dans la puce du côlon sont décrites dans le protocole, la perturbation de la barrière épithéliale étant effectuée à l’aide de cytokines caractéristiques impliquées dans la pathogenèse de la MII. En bref, les organoïdes dérivés de biopsies humaines sont propagés in vitro, soumis à une digestion enzymatique et introduits dans le canal supérieur de la puce. En présence d’une perfusion continue avec des milieux enrichis en facteur de croissance, ils se développent en une monocouche épithéliale confluente avec une architecture 3D et une surface cellulaire apicale facilement accessible. Le compartiment inférieur de la puce « vasculaire » est ensemencé de cellules endothéliales microvasculaires isolées du petit ou du gros intestin. L’épithélium et l’endothélium sont séparés par une membrane extensible poreuse, qui facilite les interactions paracrines entre les deux tissus et, lorsqu’ils sont soumis à des déformations cycliques, émule les mouvements de l’intestin humain semblables à ceux du péristaltisme. La co-culture est maintenue dans les conditions d’écoulement dynamique générées par la perfusion luminale et vasculaire avec des milieux de culture cellulaire appropriés. Enfin, nous décrivons de nombreux types d’essais et d’analyses des paramètres qui peuvent être effectués directement sur puce ou à partir d’effluents de culture cellulaire échantillonnés.
Protocol
Representative Results
Discussion
La combinaison de la technologie des organes sur puce et des organoïdes intestinaux est prometteuse pour une modélisation précise de la physiologie intestinale humaine et de la physiopathologie. Ici, nous fournissons un protocole étape par étape simple et robuste (décrit à la figure 1) pour l’établissement de la puce intestinale contenant l’épithélium de l’intestin grêle ou du côlon dérivé de la biopsie et des cellules endothéliales microvasculaires intestinales co-culti…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions le professeur Mark Donowitz pour avoir fourni les organoïdes dérivés de la biopsie intestinale et Brett Clair pour la conception des illustrations scientifiques de la puce, du module portable et du module de culture. Toutes les autres illustrations scientifiques ont été générées à l’aide du BioRender.
Materials
| small intestine Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| colon Human Intestinal Microvascular Endothelial Cells | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0.5 cells M/ml ; cryopreserved |
| Biopsy-derived Human Duodenal Organoids | John Hopkin's University | – | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Biopsy-derived Human Colonic Organoids | John Hopkin's University | – | The organoids were provided by Professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Zoë CM-1™ Culture Module | Emulate Inc. | – | Culture module |
| Orb-HM1™ Hub Module | Emulate Inc. | – | 5% CO2, vacuum stretch, and power supply |
| Chip-S1™ Stretchable Chip | Emulate Inc. | – | Organ-Chip |
| Pod™ Portable Modules | Emulate Inc. | – | Portable module |
| UV Light Box | Emulate Inc. | – | – |
| Chip Cradle | Emulate Inc. | – | 1 per square culture dish |
| Steriflip®-HV Filters | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0.45 μm PVDF filter |
| Square Cell Culture Dish (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068 | – |
| Handheld vacuum aspirator | Corning | 4930 | - |
| Aspirating pipettes | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polystyrene, individually wrapped |
| Aspirating tips | - | Sterile (autoclaved) | |
| Serological pipettes | - | 2 mL, 5 mL, 10 mL, and 25 mL low endotoxin, sterile | |
| Pipette | P20, P200, P1000 and standard multichannel | ||
| Pipette tips | P20, P200, and P1000. | ||
| Conical tubes (Protein LoBind® Tubes) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | 15 mL, 50 mL tubes |
| Eppendorf Tubes® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | 1.5 mL tubes |
| 96 wells black walled plate | – | – | for epithelial permeability analysis |
| Microscope (with camera) | – | – | For bright-field imaging |
| Water bath (or beads) | – | – | Set to 37°C |
| Vacuum set-up | - | – | Minimum pressure: -70 kPa |
| Cell scrapers | Biotium | 220033 | |
| T75 flasks | BD Falcon | 353136 | Cell culture flask |
| Emulate Reagent-1 (ER-1) | Emulate Inc. | – | Chip coating solution |
| Emulate Reagent-2 (ER-2) | Emulate Inc. | – | Chip coating solution |
| Dulbecco’s PBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | For cell counting |
| TryplE Express | ThermoFisher Scientific | 12604013 | Organoids dissociation and endothelium cells detachment solution |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientific | 12634028 | Medium |
| IntestiCult™ Organoid Growth Medium (Human) | Stem Cell technologies | 06010 | Organoid Growth Medium |
| Endothelial Cell Growth Medium MV 2 | Promocell | C-22121 | Endothelial medium |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F4135 | Serum |
| Primocin™ | InvivoGen | ANT-PM-1 | antimicrobial agent |
| Attachment Factor™ | Cell Systems | 4Z0-210 | coating solution for flask |
| Matrigel – Growth Factor Reduced | Corning | 356231 | Solubilized basement membrane matrix |
| Collagen IV | Sigma | C5533 | ECM component |
| Fibronectin | Corning | 356008 | ECM component |
| Y-27632 | Stem Cell technologies | 72304 | organoid media supplement |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | organoid media supplement |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | Basement mebrane matrix dissociationsolution |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9576 | 30%, Sterile |
| Cell Culture Grade Water | Corning | MT25055CV | Sterile, Water |
| DMSO | Sigma | D2650 | solvent |
| 3KDa Dextran Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg powder |
| Rifampicin (RIF) | Sigma | Cat# R3501 | CYP inducer |
| Testosterone hydrate | Sigma | T1500 | CYP substrate |
| 1,25-dihyroxy Vitamin D3 (VD3) | Sigma | Cat# D1530 | CYP inducer |
| Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid | Sigma | 159002 | LCMS stop solution |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% Paraformaldehyde (PFA) | EMS | 157-4 | Fixative |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | Sigma | 566460 | |
| anti-Occludin | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | tight junctions marker |
| anti-Claudin 4 | ThermoFisher Scientific | 36-4800 | tight junctions marker |
| anti-E-cadherin | Abcam | ab1416 | epithelial adherens junctions marker |
| anti-VE-cadherin | Abcam | ab33168 | endothelial adherent junctions marker |
| anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 339194 | tight junctions marker |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | nuclear stain |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | RNA lysis, isolation and purification kit |
| SuperScript™ IV VILO™ Master Mix | Invitrogen | 11756050 | reverse transcriptase kit |
| TaqMan™ Fast Advanced Master Mix | Applied Biosystems | 4444557 | qPCR reagent |
| QuantStudio™ 5 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28573 | Real-time PCR cycler |
| 18S primer | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | Eukaryotic 18S rRNA |
| CYP3A4 primer | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Cytochrome family 3 subfamily A member 4 |
| Pierce™ Coomassie Plus (Bradford) Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23236 | Protein quantification kit |
| MSD Tris lysis buffer | Meso Scale Diagnostics | R60TX-3 | Protein lysis buffer |
| Cleaved/Total Caspase-3 Whole Cell Lysate Kit | Meso Scale Diagnostics | K15140D | Caspase 3 detection kit |
| V-PLEX Vascular Injury Panel 2 Human Kit | Meso Scale Diagnostics | K15198D | |
| V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) | Meso Scale Diagnostics | K15053D | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss | – | Confocal microscope |
| Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss | – | 20X long-distance objective lenses |
| Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss | – | Brightfield microscope |
| Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Zeiss | – | 10X objective lenses |
Riferimenti
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