Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia e le tecnologie organ-on-a-chips sono combinati in una piattaforma microfisiologica per ricapitolare la funzionalità intestinale specifica della regione.
Articolo metodologico
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Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia e le tecnologie organ-on-a-chips sono combinati in una piattaforma microfisiologica per ricapitolare la funzionalità intestinale specifica della regione.
La mucosa intestinale è una complessa barriera fisica e biochimica che svolge una miriade di funzioni importanti. Consente il trasporto, l'assorbimento e il metabolismo di nutrienti e xenobiotici, facilitando al contempo una relazione simbiotica con il microbiota e limitando l'invasione di microrganismi. L'interazione funzionale tra vari tipi di cellule e il loro ambiente fisico e biochimico è vitale per stabilire e mantenere l'omeostasi del tessuto intestinale. Modellare queste complesse interazioni e la fisiologia intestinale integrata in vitro è un obiettivo formidabile con il potenziale per trasformare il modo in cui nuovi bersagli terapeutici e farmaci candidati vengono scoperti e sviluppati.
Organoidi e tecnologie Organ-on-a-Chip sono stati recentemente combinati per generare chip intestinali rilevanti per l'uomo adatti allo studio degli aspetti funzionali della fisiologia intestinale e della fisiopatologia in vitro. Gli organoidi derivati dalle biopsie dell'intestino tenue (duodeno) e crasso vengono seminati nel compartimento superiore di un chip d'organo e quindi si espandono con successo come monostrati preservando le distinte caratteristiche cellulari, molecolari e funzionali di ciascuna regione intestinale. Le cellule endoteliali microvascolari specifiche del tessuto dell'intestino umano sono incorporate nel compartimento inferiore del chip dell'organo per ricreare l'interfaccia epitelio-endoteliale. Questa nuova piattaforma facilita l'esposizione luminale a sostanze nutritive, farmaci e microrganismi, consentendo studi sul trasporto intestinale, la permeabilità e le interazioni ospite-microbo.
Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per la creazione di chip intestinali che rappresentano il duodeno umano (chip di duodeno) e il colon (chip del colon) e la loro successiva coltura sotto flusso continuo e deformazioni simili alla peristalsi. Dimostriamo metodi per valutare il metabolismo dei farmaci e l'induzione del CYP3A4 nel chip di duodeno utilizzando induttori e substrati prototipici. Infine, forniamo una procedura passo-passo per la modellazione in vitro dell'interruzione della barriera mediata dall'interferone gamma (IFNγ) (sindrome dell'intestino permeabile) in un chip del colon, compresi i metodi per valutare l'alterazione della permeabilità paracellulare, i cambiamenti nella secrezione di citochine e la profilazione trascrittomica delle cellule all'interno del chip.
L'intestino umano è un organo complesso e multitasking capace di auto-rigenerazione. È diviso nell'intestino tenue e crasso. La funzione primaria dell'intestino tenue è quella di digerire ulteriormente il cibo proveniente dallo stomaco, assorbire tutti i nutrienti e trasmettere il residuo all'intestino crasso, che recupera l'acqua e gli elettroliti. L'intestino tenue è ulteriormente diviso in più regioni anatomicamente distinte: il duodeno, il digiuno e l'ileo, ognuno dei quali è adattato per svolgere funzioni specifiche. Ad esempio, il duodeno aiuta a scomporre il chimo (contenuto dello stomaco) per consentire il corretto assorbimento dei nutrienti che coinvolgono pr....
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NOTA: Tutte le colture cellulari devono essere gestite utilizzando una tecnica asettica adeguata.
Gli organoidi intestinali umani impiegati in questo studio sono stati ottenuti dalla Johns Hopkins University e tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti approvati. Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).
1. Preparazione dei reagenti di coltura cellulare
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La Figura 1D riassume la cronologia della coltura del chip intestinale e illustra le cellule endoteliali intestinali e gli organoidi prima e dopo la semina sul chip. Inoltre, dimostra le distinte differenze morfologiche tra il duodeno e i chip del colon, evidenziate dalla presenza delle formazioni villi-like nel chip del duodeno e rappresentative dell'architettura del piccolo intestino.
La Figura 3A,B mostra le rispos.......
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La combinazione della tecnologia organ-on-a-chip e degli organoidi intestinali promette una modellazione accurata della fisiologia intestinale umana e della fisiopatologia. Qui, forniamo un protocollo passo-passo semplice e robusto (delineato nella Figura 1) per la creazione del chip intestinale contenente epitelio intestinale o del colon derivato dalla biopsia e cellule endoteliali microvascolari intestinali co-coltivate in un dispositivo microfluidico. Questa simulazione basata su chip del.......
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Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi e Magdalena Kasendra sono dipendenti attuali o precedenti di Emulate Inc. e possono detenere azioni proprie. Emulate Inc. è la società che produce i dispositivi a chip d'organo e ha pubblicato brevetti relativi al lavoro dichiarato in questo articolo.
Ringraziamo il professor Mark Donowitz per aver fornito gli organoidi derivati dalla biopsia intestinale e Brett Clair per aver progettato le illustrazioni scientifiche del chip, del portatile e del modulo di coltura. Tutte le altre illustrazioni scientifiche sono state generate utilizzando il BioRender.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| tenue Cellule endoteliali microvascolari intestinali umane | AlphaBioRegen | ALHE15 | 0,5 cellule M/ml ; colon crioconservato |
| Cellule endoteliali microvascolari intestinali umane | AlphaBioRegen | ALHE16 | 0,5 cellule M/ml ; |
| organoidi duodenali umani derivati da biopsia | di John Hopkin | - | Gli organoidi sono stati forniti dal professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329). |
| Organoidi del colon umano derivati dalla biopsia Università | di John Hopkin-Gli | organoidi sono stati forniti dal professor Mark Donowitz (numero del comitato di revisione istituzionale: NA_00038329). | |
| Zoë CM-1&commercio; Modulo | Cultura Emulate Inc. | - | Modulo di cultura |
| Orb-HM1&commercio; Modulo Hub | Emulate Inc. | - | 5% CO2, allungamento sottovuoto e alimentazione |
| Chip-S1™ Chip estensibile | emulare Inc. | - | Pod per chip d'organo |
| &commercio; Moduli portatili | Emulate Inc. | - | Modulo portatile |
| UV Light Box | Emulate Inc. | - | - |
| Chip Cradle | Emulate Inc. | - | 1 per piatto di coltura quadrato |
| Steriflip®-HV Filtri | EMD Millipore | SE1M003M00 | 0,45 μ m Filtro PVDF |
| Piatto di coltura cellulare quadrato (120 x 120 mm) | VWR | 82051-068-Handheld | |
| vuoto aspiratore | Corning | 4930 | - |
| Aspirante pipette | Corning / Falcon | 357558 | 2 mL, polistirolo, individualmente Punte di aspirazione avvolte |
| - | Sterili (autoclavate) | ||
| Sierologiche pipette | - | 2 mL, 5 mL, 10 ml, e 25 ml a basso contenuto di endotossine, sterile | |
| Pipetta | P20, P200, P1000 e pipetta multicanale standard | ||
| suggerimenti | P20, P200, e P1000. | ||
| Tubi conici ( Proteine LoBind® Tubi) | Eppendorf | 0030122216; 0030122240 | provette da 15 mL, 50 mL |
| Eppendorf Tubi® lo-bind | Eppendorf | 022431081 | provette da 1,5 mL |
| 96 pozzetti piastra a parete nera | - | per analisi della permeabilità epiteliale | |
| Microscopio (con fotocamera) | - | per campo chiaro imaging | |
| Bagno d'acqua (o perline) | - | Impostare a 37 gradi C | |
| Impostazione del vuoto | - | - | Minimo pressione: -70 kPa |
| Raschietti cellulari | Fiasche di biozio | 220033 | |
| T75 | Balloni BD Falcon | 353136 | Fiaschetta per colture cellulari |
| Emulare Reagent-1 ( ER-1) | Emulare Inc. | - | Soluzione di rivestimento per trucioli |
| Emulare il reagente-2 ( ER-2) | Emulare Inc. | - | Soluzione di rivestimento trucioli |
| Dulbecco' s PBS (DPBS) | Corning | 21-031-CV | 1X |
| Acqua per colture cellulari | Corning | MT25055CV | |
| Trypan blue | Sigma | 93595 | Per il conteggio delle cellule |
| TryplE Espresso | ThermoFisher Organoidi | 12604013 | Scientifici dissociazione e cellule dell'endotelio distacco soluzione |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher Scientifico | 12634028 | Medio |
| Processo Commerciale Terreno di crescita degli organoidi (umano) | Tecnologie delle cellule staminali | 06010 | Terreno di crescita degli organoidi |
| Terreno di crescita delle cellule endoteliali MV 2 | Promocell | C-22121 | Terreno endoteliale |
| Siero fetale bovino (FBS) | Sigma | F4135 | Siero |
| Primocin&commercio; | InvivoGen | ANT-PM-1 | agente antimicrobico Fattore di attaccamento |
| &commercio; | Cell Systems | Soluzione di rivestimento 4Z0-210 | per pallone |
| Matrigel - Fattore di crescita Ridotto | Corning | 356231 | Matrice di membrana basale solubilizzata |
| Collagene IV | Sigma | C5533 | Componente ECM |
| Fibronectina | Corning | 356008 | componente ECM |
| Y-27632 | Tecnologie delle cellule staminali | 72304 | integratore di terreni organoidi |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-10 | integratore di terreni organoidi |
| Soluzione di recupero cellulare | Corning | 354253 | Soluzione di dissociazione della matrice di mebrane basale |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma | A9576 | 30%, Acqua sterile |
| coltura cellulare | Corning | MT25055CV | sterile, |
| acqua DMSO | Sigma | D2650 | solvente |
| 3KDa destrano Cascade Blue | Invitrogen | D7132 | 10 mg polvere |
| Rifampicina (RIF) | Induttore CYP Sigma | Cat# R3501 | Induttore CYP |
| Testosterone idrato | Substrato CYP Sigma | T1500 | Substrato |
| 1,25-diirossi Vitamina D3 (VD3) | Induttore CYP Sigma | Cat# D1530 | Induttore CYP |
| Acetonitrile con acido formico 0,1% (v/v) | Sigma | 159002 | Soluzione di arresto LCMS |
| IFNγ | Peprotech | 300-02 | |
| 4% Paraformaldeide (PFA) | EMS | 157-4 | Fissativo |
| Triton-X 100 | Sigma | T8787 | |
| Siero d'asino normale (NDS) | Sigma | 566460 | |
| anti-occludina | ThermoFisher Scientific | 33-1500 | marcatore a giunzioni strette |
| anti-Claudin 4 | ThermoFisher Scientific | 36-4800 | marcatore di giunzioni strette |
| anti-E-caderina | Abcam | ab1416 | marcatore di giunzioni aderenti epiteliali |
| anti-VE-caderina | Abcam | ab33168 | marcatore di giunzioni aderenti endoteliali |
| anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1) | Thermo Fischer | 339194 | marcatore di giunzioni strette |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | 62248 | colorazione nucleare |
| 2-mercaptoetanolo | Sigma | M6250 | |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183020 | Kit di lisi, isolamento e purificazione dell'RNA |
| SuperScript&; IV VILO&commercio; Master Mix | Invitrogen | 11756050 | kit per trascrittasi inversa |
| TaqMan™ Fast Advanced Master Mix | Applied Biosystems | 4444557 | reagente qPCR |
| QuantStudio™ 5 Sistema di PCR in tempo reale | Applied Biosystems | A28573 | Cycler per PCR in tempo reale |
| 18S primer | ThermoFisher Scientific | Hs99999901_s1 | Eukaryotic 18S rRNA |
| CYP3A4 primer | ThermoFisher Scientific | Hs00604506_m1 | Famiglia dei citocromo 3 sottofamiglia A membro 4 |
| Pierce™ Kit di analisi Coomassie Plus (Bradford) | ThermoFisher Scientific | 23236 | Kit di quantificazione delle proteine |
| Tampone di lisi MSD Tris | Diagnostica su scala Meso | R60TX-3 | Tampone di lisi proteica |
| Kit di lisato a cellule intere Cleaved/Total Caspase-3 | K15140D | scala Meso Kit | rilevamento della della caspasi 3 |
| Kit V-PLEX Pannello per lesioni vascolari 2 Kit per l'uomo | Diagnostica su scala Meso | K15198D | |
| V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) | Diagnostica su scala | meso K15053D | |
| Zeiss LSM 880 | Zeiss-Microscopio | confocale | |
| Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27 | Zeiss-20X | Lenti per obiettivi a lunga distanza | |
| Zeiss AXIOvert.A1 | Zeiss-Brightfield | microscopio | |
| Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1 | Obiettivi Zeiss-10X |
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