Method Article

Combinazione di organoidi umani e tecnologia Organ-on-a-Chip per modellare la funzionalità specifica della regione intestinale

DOI:

10.3791/63724

⸱

May 5th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Emulate Inc. Boston, 2Center for Stem Cell and Organoid Medicine, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, 3Division of Pediatric General and Thoracic Surgery, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli organoidi intestinali derivati dalla biopsia e le tecnologie organ-on-a-chips sono combinati in una piattaforma microfisiologica per ricapitolare la funzionalità intestinale specifica della regione.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La mucosa intestinale è una complessa barriera fisica e biochimica che svolge una miriade di funzioni importanti. Consente il trasporto, l'assorbimento e il metabolismo di nutrienti e xenobiotici, facilitando al contempo una relazione simbiotica con il microbiota e limitando l'invasione di microrganismi. L'interazione funzionale tra vari tipi di cellule e il loro ambiente fisico e biochimico è vitale per stabilire e mantenere l'omeostasi del tessuto intestinale. Modellare queste complesse interazioni e la fisiologia intestinale integrata in vitro è un obiettivo formidabile con il potenziale per trasformare il modo in cui nuovi bersagli terapeutici e farmaci candidati vengono scoperti e sviluppati.

Organoidi e tecnologie Organ-on-a-Chip sono stati recentemente combinati per generare chip intestinali rilevanti per l'uomo adatti allo studio degli aspetti funzionali della fisiologia intestinale e della fisiopatologia in vitro. Gli organoidi derivati dalle biopsie dell'intestino tenue (duodeno) e crasso vengono seminati nel compartimento superiore di un chip d'organo e quindi si espandono con successo come monostrati preservando le distinte caratteristiche cellulari, molecolari e funzionali di ciascuna regione intestinale. Le cellule endoteliali microvascolari specifiche del tessuto dell'intestino umano sono incorporate nel compartimento inferiore del chip dell'organo per ricreare l'interfaccia epitelio-endoteliale. Questa nuova piattaforma facilita l'esposizione luminale a sostanze nutritive, farmaci e microrganismi, consentendo studi sul trasporto intestinale, la permeabilità e le interazioni ospite-microbo.

Qui, viene fornito un protocollo dettagliato per la creazione di chip intestinali che rappresentano il duodeno umano (chip di duodeno) e il colon (chip del colon) e la loro successiva coltura sotto flusso continuo e deformazioni simili alla peristalsi. Dimostriamo metodi per valutare il metabolismo dei farmaci e l'induzione del CYP3A4 nel chip di duodeno utilizzando induttori e substrati prototipici. Infine, forniamo una procedura passo-passo per la modellazione in vitro dell'interruzione della barriera mediata dall'interferone gamma (IFNγ) (sindrome dell'intestino permeabile) in un chip del colon, compresi i metodi per valutare l'alterazione della permeabilità paracellulare, i cambiamenti nella secrezione di citochine e la profilazione trascrittomica delle cellule all'interno del chip.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L'intestino umano è un organo complesso e multitasking capace di auto-rigenerazione. È diviso nell'intestino tenue e crasso. La funzione primaria dell'intestino tenue è quella di digerire ulteriormente il cibo proveniente dallo stomaco, assorbire tutti i nutrienti e trasmettere il residuo all'intestino crasso, che recupera l'acqua e gli elettroliti. L'intestino tenue è ulteriormente diviso in più regioni anatomicamente distinte: il duodeno, il digiuno e l'ileo, ognuno dei quali è adattato per svolgere funzioni specifiche. Ad esempio, il duodeno aiuta a scomporre il chimo (contenuto dello stomaco) per consentire il corretto assorbimento dei nutrienti che coinvolgono pr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOTA: Tutte le colture cellulari devono essere gestite utilizzando una tecnica asettica adeguata.

Gli organoidi intestinali umani impiegati in questo studio sono stati ottenuti dalla Johns Hopkins University e tutti i metodi sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti approvati. Tutti i protocolli sperimentali sono stati approvati dal Johns Hopkins University Institutional Review Board (IRB #NA 00038329).

1. Preparazione dei reagenti di coltura cellulare

  1. Preparare il mezzo di crescita organoide umano seguendo le istruzioni del produttore (Tabella dei mat....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La Figura 1D riassume la cronologia della coltura del chip intestinale e illustra le cellule endoteliali intestinali e gli organoidi prima e dopo la semina sul chip. Inoltre, dimostra le distinte differenze morfologiche tra il duodeno e i chip del colon, evidenziate dalla presenza delle formazioni villi-like nel chip del duodeno e rappresentative dell'architettura del piccolo intestino.

La Figura 3A,B mostra le rispos.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La combinazione della tecnologia organ-on-a-chip e degli organoidi intestinali promette una modellazione accurata della fisiologia intestinale umana e della fisiopatologia. Qui, forniamo un protocollo passo-passo semplice e robusto (delineato nella Figura 1) per la creazione del chip intestinale contenente epitelio intestinale o del colon derivato dalla biopsia e cellule endoteliali microvascolari intestinali co-coltivate in un dispositivo microfluidico. Questa simulazione basata su chip del.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gauri Kulkarni, Athanasia Apostolou, Lorna Ewart, Carolina Lucchesi e Magdalena Kasendra sono dipendenti attuali o precedenti di Emulate Inc. e possono detenere azioni proprie. Emulate Inc. è la società che produce i dispositivi a chip d'organo e ha pubblicato brevetti relativi al lavoro dichiarato in questo articolo.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ringraziamo il professor Mark Donowitz per aver fornito gli organoidi derivati dalla biopsia intestinale e Brett Clair per aver progettato le illustrazioni scientifiche del chip, del portatile e del modulo di coltura. Tutte le altre illustrazioni scientifiche sono state generate utilizzando il BioRender.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

intestino crioconservata Università per Kit di rilevamento della su di

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
tenue Cellule endoteliali microvascolari intestinali umaneAlphaBioRegenALHE150,5 cellule M/ml ; colon crioconservato
Cellule endoteliali microvascolari intestinali umaneAlphaBioRegenALHE160,5 cellule M/ml ;
organoidi duodenali umani derivati da biopsiadi John Hopkin-Gli organoidi sono stati forniti dal professor Mark Donowitz (Institutional Review Board Number: NA_00038329).
Organoidi del colon umano derivati dalla biopsia Universitàdi John Hopkin-Gliorganoidi sono stati forniti dal professor Mark Donowitz (numero del comitato di revisione istituzionale: NA_00038329).
Zoë CM-1&commercio;   ModuloCultura Emulate Inc.-Modulo di cultura
Orb-HM1&commercio;   Modulo HubEmulate Inc.-5% CO2, allungamento sottovuoto e alimentazione
Chip-S1™ Chip estensibileemulare Inc.-Pod per chip d'organo
&commercio; Moduli portatiliEmulate Inc.-Modulo portatile
UV Light BoxEmulate Inc.--
Chip CradleEmulate Inc.-1 per piatto di coltura quadrato
Steriflip®-HV FiltriEMD MilliporeSE1M003M000,45  μ m  Filtro PVDF
Piatto di coltura cellulare quadrato (120 x 120 mm)VWR82051-068-Handheld
  vuoto  aspiratoreCorning4930 -
Aspirante  pipetteCorning / Falcon3575582 mL,  polistirolo, individualmente  Punte di aspirazione avvolte
 -Sterili (autoclavate)
Sierologiche  pipette -2 mL, 5 mL,  10 ml,  e  25 ml a basso contenuto di endotossine, sterile
PipettaP20, P200,  P1000  e pipetta multicanale standard
  suggerimenti P20, P200,  e  P1000.
Tubi conici ( Proteine  LoBind® Tubi)Eppendorf0030122216;   0030122240provette da 15 mL, 50 mL
Eppendorf  Tubi®   lo-bindEppendorf022431081provette da 1,5 mL
96 pozzetti piastra a parete nera-per analisi della permeabilità epiteliale
Microscopio (con fotocamera)-per campo chiaro imaging
Bagno d'acqua (o perline)-Impostare a 37 gradi C
Impostazione del vuoto --Minimo  pressione: -70 kPa
Raschietti cellulariFiasche di biozio220033
T75Balloni BD Falcon353136Fiaschetta per colture cellulari
Emulare Reagent-1 ( ER-1)Emulare Inc.-Soluzione di rivestimento per trucioli
Emulare il reagente-2 ( ER-2)Emulare Inc.-Soluzione di rivestimento trucioli
Dulbecco' s PBS  (DPBS)Corning21-031-CV1X
Acqua per colture cellulariCorningMT25055CV
Trypan blueSigma93595Per il conteggio delle cellule
TryplE  EspressoThermoFisher  Organoidi12604013Scientifici  dissociazione  e cellule dell'endotelio  distacco  soluzione
Advanced DMEM/F12ThermoFisher  Scientifico12634028Medio
Processo Commerciale Terreno di crescita degli organoidi (umano)Tecnologie delle cellule staminali06010Terreno di crescita degli organoidi
Terreno di crescita delle cellule endoteliali MV 2PromocellC-22121Terreno endoteliale
Siero fetale bovino (FBS)SigmaF4135Siero
Primocin&commercio;  InvivoGenANT-PM-1agente antimicrobico Fattore di attaccamento
&commercio;Cell SystemsSoluzione di rivestimento 4Z0-210per pallone
Matrigel - Fattore di crescita RidottoCorning356231Matrice di membrana basale solubilizzata
Collagene IVSigmaC5533Componente ECM
FibronectinaCorning356008componente ECM
Y-27632Tecnologie delle cellule staminali72304integratore di terreni organoidi
CHIR99021Reprocell04-0004-10integratore di terreni organoidi
Soluzione di recupero cellulareCorning354253Soluzione di dissociazione della matrice di mebrane basale
Albumina sierica bovina (BSA)SigmaA957630%, Acqua sterile
coltura cellulareCorningMT25055CVsterile,
acqua DMSOSigmaD2650solvente
3KDa destrano Cascade BlueInvitrogenD713210 mg polvere
Rifampicina (RIF)Induttore CYP SigmaCat# R3501Induttore CYP
Testosterone idratoSubstrato CYP SigmaT1500Substrato
1,25-diirossi Vitamina D3 (VD3)Induttore CYP SigmaCat# D1530Induttore CYP
Acetonitrile con acido formico 0,1% (v/v)Sigma159002Soluzione di arresto LCMS
IFNγPeprotech300-02
4% Paraformaldeide (PFA)EMS157-4Fissativo
Triton-X 100SigmaT8787
Siero d'asino normale (NDS)Sigma566460
anti-occludinaThermoFisher  Scientific33-1500marcatore a giunzioni strette
anti-Claudin 4ThermoFisher  Scientific36-4800marcatore di giunzioni strette
anti-E-caderinaAbcamab1416marcatore di giunzioni aderenti epiteliali
anti-VE-caderinaAbcamab33168marcatore di giunzioni aderenti endoteliali
anti- Zonula Occludens 1 (ZO-1)Thermo Fischer339194marcatore di giunzioni strette
DAPIThermoFisher  Scientific62248colorazione nucleare
2-mercaptoetanoloSigmaM6250
PureLink RNA Mini KitInvitrogen12183020Kit di lisi, isolamento e purificazione dell'RNA
SuperScript&; IV VILO&commercio; Master MixInvitrogen11756050kit per trascrittasi inversa
TaqMan™ Fast Advanced Master MixApplied Biosystems4444557reagente qPCR
QuantStudio™ 5 Sistema di PCR in tempo realeApplied BiosystemsA28573Cycler per PCR in tempo reale
18S primerThermoFisher ScientificHs99999901_s1Eukaryotic 18S rRNA
CYP3A4 primerThermoFisher ScientificHs00604506_m1Famiglia dei citocromo 3 sottofamiglia A membro 4
Pierce™ Kit di analisi Coomassie Plus (Bradford)ThermoFisher Scientific23236Kit di quantificazione delle proteine
Tampone di lisi MSD TrisDiagnostica su scala MesoR60TX-3Tampone di lisi proteica
Kit di lisato a cellule intere Cleaved/Total Caspase-3K15140Dscala Meso Kitrilevamento della della caspasi 3
Kit V-PLEX Pannello per lesioni vascolari 2 Kit per l'uomoDiagnostica su scala MesoK15198D
V-PLEX Human Proinflammatory Panel II (4-Plex)Diagnostica su scalameso K15053D
Zeiss LSM 880Zeiss-Microscopioconfocale
Zeiss LD plan-Neofluar 20x/0.40 Korr M27Zeiss-20XLenti per obiettivi a lunga distanza
Zeiss AXIOvert.A1Zeiss-Brightfieldmicroscopio
Zeiss LD A-Plan 10X/0.25 Ph1Obiettivi Zeiss-10X

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fritz, A., et al. Expression of clinically relevant drug-metabolizing enzymes along the human intestine and their correlation to drug transporters and nuclear receptors: An intra-subject analysis. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 124 (3), 245-255 (2019).
  2. Okumura, R., Takeda, K.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human OrganoidsOrgan On A ChipIntestine ChipIntestinal BarrierEpithelial MonolayerParacellular PermeabilityDrug MetabolismCYP3A4 InductionHost Microbe InteractionInterferon Gamma

Related Articles