Denne protokol beskriver et komparativt assay ved hjælp af mitokondrielle komplekse aktiviteter CI + CIII og CII + CIII i nærvær eller fravær af Na + for at studere eksistensen af delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer.
Ubiquinon (CoQ) puljer i den indre mitokondriemembran (IMM) er delvist segmenteret til enten komplekse I eller FAD-afhængige enzymer. En sådan opdeling kan let vurderes ved et komparativt assay ved anvendelse af NADH eller succinat som elektrondonorer i frosne optøede mitokondrier, hvor cytokrom c (cyt c) reduktion måles. Assayet er afhængig af effekten af Na + på IMM, hvilket reducerer dets fluiditet. Her præsenterer vi en protokol til måling af NADH-cyt c oxidoreduktaseaktivitet og succinat-cyt c oxidoreduktaseaktiviteter i nærvær af NaCl eller KCl. Reaktionerne, der er afhængige af blandingen af reagenser i en kuvette trinvist, måles spektrofotometrisk i løbet af 4 minutter i nærværelse af Na+ eller K+. Den samme blanding udføres parallelt i nærvær af de specifikke enzymhæmmere for at trække den uspecifikke ændring i absorbans fra. NADH-cyt c oxidoreduktaseaktivitet falder ikke i nærvær af nogen af disse kationer. Imidlertid falder succinat-cyt c oxidoreductaseaktiviteten i nærvær af NaCl. Dette enkle eksperiment fremhæver: 1) effekten af Na + i faldende IMM-fluiditet og CoQ-overførsel; 2) at superkompleks I+III2 beskytter ubiquinon (CoQ) overførsel mod at blive påvirket af sænkning af IMM fluiditeten; 3) at CoQ-overførslen mellem CI og CIII er funktionelt forskellig fra CoQ-overførslen mellem CII og CIII. Disse fakta understøtter eksistensen af funktionelt differentierede CoQ-puljer i IMM og viser, at de kan reguleres af mitokondriernes skiftende Na+- miljø.
Mitokondrielt oxidativt fosforyleringssystem (OXPHOS) er den vigtigste vej, der driver adenosintrifosfatsyntese (ATP), reaktiv iltartsproduktion (ROS) og forbrug af reducerende ækvivalenter, såsom nikotinamid adenindinukleotid (NADH) eller succinat, af mitokondrier. OXPHOS-systemet består af fem proteinkomplekser: Kompleks I (CI) oxiderer NADH og reducerer CoQ til ubiquinol (CoQH2). Kompleks II (CII) oxiderer succinat tilfumarat og reducerer CoQ til CoQH2. Kompleks III (CIII) oxiderer CoQH2 tilbage til CoQ, hvilket reducerer cytokrom c (cyt c). Endelig oxiderer kompleks IV (CIV) cyt c og reducerer ilt til vand. Denne oxidoreduktionskæde, den såkaldte elektrontransportkæde (mETC), er koblet til pumpning af H + over IMM, hvilket skaber en elektrokemisk gradient, der anvendes af kompleks V (CV) til fosforylat adenosindiphosphat (ADP) i ATP.
mETC-komplekser kan enten være alene i IMM eller samles i kvaternære strukturer kaldet superkomplekser. CIV kan samles med CIII og danne III2+IV eller Q-respirasomet (da det er i stand til at respirere i nærvær af CoQH2)1,2,3 eller danne homodimerer eller homooligomerer4. CIII kan interagere med CI og danne superkomplekset I+ III25. Endelig er CI også i stand til at interagere med Q-respirasomet og opbygge I + III2 + IV eller N-respirasomet (da det kan respirere forbrugende NADH) 1,6,7,8,9,10.
CoQ og cyt c er mobile elektronbærere, der har ansvaret for at overføre elektroner fra henholdsvis CI / CII til CIII og fra CIII til CIV. Hvorvidt superkomplekser pålægger en funktionel lokal begrænsning for disse luftfartsselskaber har været et spørgsmål om intens debat gennem de sidste to årtier 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Flere uafhængige grupper har imidlertid vist, at CoQ og cyt c funktionelt kan segmenteres i puljer i IMM. Med hensyn til CoQ kan den funktionelt segmenteres i en specifik CoQ-pulje for CI (CoQNAD) og en anden pulje dedikeret til FAD-afhængige enzymer (CoQFAD)1,7,12,18,19. For at differentiere eksistensen af delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer var overekspression af den alternative oxidase (AOX) og generering af specifikke mtDNA-mutanter, som kan samle CI i fravær af CIII, imidlertid påkrævet 1,19,20.
Mekanismen for reaktiv iltart (ROS) produktion under hypoxi var ukendt indtil for nylig. Ved akut hypoxi gennemgår CI den aktive/deaktive (A/D) overgang, som indebærer et fald i dets H+ -pumpende NADH-CoQ oxidoreduktaseaktivitet. Et sådant fald i H + -pumpning syrner mitokondriematrixen og opløser delvist calciumphosphatudfælderne i mitokondriematrixen og frigiver opløselig Ca2+. Denne stigning i opløselig Ca2+ aktiverer Na+/Ca2+- veksleren (NCLX), som ekstruderer Ca2+ i bytte for Na+. Mitokondriel Na + -stigning interagerer med phospholipider i indersiden af IMM, hvilket reducerer dets fluiditet og CoQ-overførsel mellem CII og CIII, hvilket endelig producerer superoxidanion, et redoxsignal21. Interessant nok blev CoQ-overførslen kun formindsket mellem CII og CIII, men ikke mellem CI og CIII, hvilket fremhævede, at 1) Na + kun var i stand til at modulere en af de eksisterende CoQ-puljer i mitokondrierne; 2) der findes funktionelt differentierede CoQ-puljer i IMM. Således kan en meget anvendt protokol til undersøgelse af mitokondrielle enzymaktiviteter anvendes til at vurdere eksistensen af de nævnte CoQ-puljer.
Den nuværende protokol er baseret på måling af reduktionen af oxideret cyt c, substratet af CIII, ved absorbans i nærvær af succinat (dvs. CII-substrat) eller NADH (dvs. CI-substrat). Den samme prøve er opdelt i to, hvoraf den ene vil blive behandlet med KCl, og den anden med samme koncentration af NaCl. På denne måde, da Na + reducerer IMM-fluiditeten, hvis CoQ eksisterede i en unik pulje i IMM, ville både CI + CIII og CII + CIII falde i nærvær af Na +. Hvis CoQ eksisterede i delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer, ville effekten af Na+ imidlertid for det meste (eller kun) være tydelig på CII+CIII-aktiviteten, men ikke på CI+CIII. Som nyligt offentliggjort21 påvirker Na+ kun CoQ-overførslen mellem CII og CIII (figur 1C,D), men ikke mellem CI og CIII (figur 1A,B).
Denne protokol er sammen med et panoply af teknikker blevet brugt til at bekræfte eksistensen af delvist segmenterede funktionelle CoQ-puljer i IMM, en dedikeret til CI (dvs. CoQNAD) og en anden dedikeret til FAD-bundne enzymer (dvs. CoQFAD)1,3,7; en bemærkning, der, selv om den fortsat debatteres22, er blevet bekræftet uafhængigt af flere grupper 7,19. Således påvirker supermonteringen af CI i superkomplekser coq’s lokale mobilitet, hvilket letter brugen af CIII inden for superkomplekset 1,7,13,14,23,24,25.
Selvom denne protokol repræsenterer en meget ligetil procedure til at identificere eksistensen af de delvist segmenterede CoQ-puljer, er der et par kritiske trin, der skal tages i betragtning. Substrater (dvs. NADH eller succinat) tilsættes fortrinsvis sidst, da autooxidering af disse forbindelser kan forekomme. Cuvettes flipping skal være forsigtig for at undgå dannelse af bobler, der kan forstyrre læsningen.
Derudover præsenterer den nuværende teknik et par begrænsninger, som er vær…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. C. Jimenez og E. R. Martínez-Jimenez for teknisk bistand. Denne undersøgelse blev støttet af MICIN: RTI2018-099357-B-I00 og HFSP (RGP0016/2018). CNIC støttes af Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) og Pro CNIC Foundation og er et Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figur 2 oprettet med BioRender.com.
Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
NADH | Roche | 10107735001 | |
Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |