רגישות הממברנה המיטוכונדריאלית הפנימית ל-Na+ חושפת בריכות CoQ פונקציונליות מפולחות חלקית
Summary
פרוטוקול זה מתאר בדיקה השוואתית, תוך שימוש בפעילויות מורכבות מיטוכונדריאליות CI+CIII ו-CII+CIII בנוכחות או בהיעדר Na+, כדי לחקור את קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית.
Abstract
בריכות יוביקינון (CoQ) בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי (IMM) מחולקות באופן חלקי לאנזימים מורכבים התלויים ב-I או ב-FAD. ניתן להעריך תת-חלוקה כזו בקלות על ידי בדיקה השוואתית באמצעות NADH או סוקסינט כתורמי אלקטרונים במיטוכונדריה מופשרת קפואה, שבה נמדדת הפחתת ציטוכרום c (cyt c). הבדיקה מסתמכת על ההשפעה של Na+ על ה-IMM, ומפחיתה את הנזילות שלו. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למדידת פעילות NADH-cyt c oxidoreductase ופעילויות succinate-cyt c oxidoreductase בנוכחות NaCl או KCl. התגובות, המסתמכות על תערובת של ריאגנטים בקובט באופן מדורג, נמדדות באופן ספקטרופוטומטרי במהלך 4 דקות בנוכחות Na+ או K+. אותה תערובת מבוצעת במקביל בנוכחות מעכבי האנזים הספציפיים על מנת להפחית את השינוי הלא ספציפי בספיגה. פעילות NADH-cyt c oxidoreductase אינה פוחתת בנוכחות אף אחד מהקטיונים הללו. עם זאת, פעילות succinate-cyt c oxidoreductase פוחתת בנוכחות NaCl. ניסוי פשוט זה מדגיש: 1) את ההשפעה של Na+ בהפחתת נזילות IMM והעברת CoQ; 2) כי סופר-קומפלקס I+III2 מגן על העברת יוביקינון (CoQ) מפני השפעה על ידי הורדת נזילות IMM; 3) כי העברת CoQ בין CI ל- CIII שונה מבחינה פונקציונלית מהעברת CoQ בין CII ל- CIII. עובדות אלה תומכות בקיומן של בריכות CoQ מובחנות מבחינה פונקציונלית ב- IMM ומראות כי ניתן לווסת אותן על ידי סביבת Na+ המשתנה של המיטוכונדריה.
Introduction
מערכת זרחון חמצוני מיטוכונדריאלי (OXPHOS) היא המסלול העיקרי המניע סינתזת אדנוזין טריפוספט (ATP), ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) וצריכת מקבילות מפחיתות, כגון ניקוטין אדנין דינוקלאוטיד (NADH) או סוקסינט, על ידי מיטוכונדריה. מערכת OXPHOS מורכבת מחמישה קומפלקסים של חלבונים: קומפלקס I (CI) מחמצן את NADH ומפחית את ה-CoQ ליוביקינול (CoQH2). קומפלקס II (CII) מחמצן את הסוקסינט לפומאראט ומפחית את ה-CoQQ ל-CoQH2. קומפלקס III (CIII) מחמצן את CoQH2 בחזרה ל-CoQ, ומפחית ציטוכרום c (cyt c). לבסוף, IV מורכב (CIV) מחמצן את cyt c ומפחית את החמצן למים. שרשרת אוקסידורדוקציה זו, מה שמכונה שרשרת הובלת האלקטרונים (mETC), מצומדת לשאיבה של H+ לרוחב ה-IMM, מה שיוצר גרדיאנט אלקטרוכימי המשמש את V (CV) המורכב כדי לזרחן אדנוזין דיפוספט (ADP) ל-ATP.
קומפלקסים של mETC יכולים להיות לבדם ב-IMM או להתאסף למבנים רבעוניים הנקראים סופר-קומפלקסים. CIV יכול להרכיב עם CIII, וליצור את III2+IV או Q-respirasome (כפי שהוא מסוגל לנשום בנוכחות CoQH2)1,2,3 או יצירת הומודימרים או הומוליגומרים4. CIII יכול לקיים אינטראקציה עם CI, ויוצר את הסופר-קומפלקס I+III25. לבסוף, CI מסוגל גם לקיים אינטראקציה עם Q-respirasome, ובונה את I+III2+IV או N-respirasome (כפי שהוא יכול לנשום לצרוך NADH)1,6,7,7,8,9,10.
CoQ ו-cyt c הם נושאי אלקטרונים ניידים האחראים על העברת אלקטרונים מ-CI/CII ל-CIII, ומ-CIII ל-CIV, בהתאמה. השאלה אם סוכני-על מטילים מגבלה מקומית פונקציונלית על נשאים אלה הייתה נושא לוויכוח עז בשני העשורים האחרוניםעל 2,7,11,12,13,14,15,16,17. עם זאת, מספר קבוצות עצמאיות הוכיחו כי ניתן לפלח את CoQ ו- cyt c באופן פונקציונלי לבריכות ב- IMM. לגבי ה-CoQ, ניתן לפלח אותו באופן פונקציונלי למאגר CoQ ספציפי עבור CI (CoQNAD) ומאגר נוסף המוקדש לאנזימים תלויי FAD (CoQFAD)1,7,12,18,19. עם זאת, על מנת להבדיל בין קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית, נדרש ביטוי יתר של האוקסידאז החלופי (AOX) ויצירת מוטנטים ספציפיים של mtDNA, שיכולים להרכיב CI בהיעדר CIII, 1,19,20.
המנגנון של ייצור מיני חמצן תגובתי (ROS) במהלך היפוקסיה לא היה ידוע עד לאחרונה. בהיפוקסיה חריפה, CI עובר את המעבר הפעיל/דה-אקטיבי (A/D), הכרוך בירידה בפעילות האוקסידורדוקטאז של NADH-CoQ השואבת את ה-H+ . ירידה כזו בשאיבת H+ מחמצצת את המטריצה המיטוכונדרית וממיסה חלקית את משקעי הסידן-פוספט במטריצה המיטוכונדרית, ומשחררת Ca2+ מסיס. עלייה זו ב-Ca2+ המסיס מפעילה את מחליף Na+/Ca2+ (NCLX), אשר מוציא את Ca2+ בתמורה ל-Na+. הגברת Na+ המיטוכונדרית מתקשרת עם פוספוליפידים בצד הפנימי של ה-IMM, מפחיתה את הנזילות שלה ואת העברת ה-CoQ שלו בין CII ל-CIII, ולבסוף מייצרת אניון סופראוקסיד, אות חמצון-חיזור21. באופן מעניין, העברת CoQ רק פחתה בין CII ל-CIII, אך לא בין CI ל-CIII, מה שמדגיש כי 1) Na+ הצליחה לווסת רק אחת מבריכות ה-CoQ הקיימות במיטוכונדריה; 2) קיימות בריכות CoQ מובחנות מבחינה פונקציונלית ב- IMM. לפיכך, פרוטוקול בשימוש נרחב לחקר פעילויות אנזים מיטוכונדריאלי יכול לשמש כדי להעריך את קיומם של בריכות CoQ שהוזכרו.
הפרוטוקול הנוכחי מבוסס על מדידת הפחתה של ציט c מחומצן, המצע של CIII, על ידי ספיגה בנוכחות סוקסינט (כלומר, מצע CII) או NADH (כלומר, מצע CI). אותה דגימה מחולקת לשניים, שאחד מהם יטופל ב- KCl, והשני עם אותו ריכוז של NaCl. בדרך זו, בהתחשב בכך ש-Na+ מקטין את נזילות ה-IMM, אם CoQ היה קיים במאגר ייחודי ב-IMM, גם CI+CIII וגם CII+CIII היו יורדים בנוכחות Na+. עם זאת, אם CoQ היה קיים במאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית, ההשפעה של Na+ הייתה ניכרת בעיקר (או רק) על פעילות CII+CIII, אך לא על CI+CIII. כפי שפורסם לאחרונה21, Na+ משפיע רק על העברת ה-CoQ בין CII ל-CIII (איור 1C,D), אך לא בין CI ל-CIII (איור 1A,B).
פרוטוקול זה, יחד עם שפע של טכניקות, שימשו כדי לאשר את קיומם של מאגרי CoQ פונקציונליים מפולחים חלקית ב-IMM, אחד המוקדש ל-CI (כלומר, CoQNAD), ואחר המוקדש לאנזימים הקשורים ל-FAD (כלומר, CoQFAD)1,3,7; תצפית שלמרות שהיא ממשיכה להתווכח22, אומתה באופן עצמאי על ידי כמה קבוצות 7,19. לפיכך, הרכבת העל של CI לתוך פלקסים סופר-קומפלקסים משפיעה על הניידות המקומית של CoQ, ומקלה על השימוש בו על ידי ה-CIII בתוך הסופר-קומפלקס 1,7,13,14,23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
למרות שפרוטוקול זה מייצג הליך פשוט מאוד לזיהוי קיומם של מאגרי CoQ המפולחים חלקית, ישנם כמה צעדים קריטיים שיש לקחת בחשבון. מצעים (כלומר, NADH או succinate) רצוי להוסיף אחרון מאז חמצון אוטומטי של תרכובות אלה עשוי להתרחש. ההיפוך של קובט חייב להיות זהיר על מנת למנוע היווצרות של בועות שעלולות להפריע לקר?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לד”ר ר. מרטינז-דה-מנה, מ. מ. מוניוז-הרננדז, א., ד”ר ק. חימנז וא.ר. מרטינז-חימנז על הסיוע הטכני. מחקר זה נתמך על ידי MICIN: RTI2018-099357-B-I00 ו- HFSP (RGP0016/2018). ה- CNIC נתמך על ידי המכון דה סאלוד קרלוס השלישי (ISCIII), השרים דה סיינסיה, Innovación y Universidades (MCNU) וקרן Pro CNIC והוא מרכז המצוינות של סברו אוצ’ואה (SEV-2015-0505). איור 2 נוצר עם BioRender.com.
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
Riferimenti
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830 (2020).
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
