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Biochimica

Na+에 대한 내부 미토콘드리아 막 민감도, 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀 공개

Published: July 20, 2022
doi:
10.3791/63729
,
1Fundación Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III CNIC, 2Centro de Investigaciones Biomédica en Red de Fragilidad y Envejecimiento, Saludable-CIBERFES

Summary

이 프로토콜은 Na+의 존재 또는 부재 하에 미토콘드리아 복합 활성 CI+CIII 및 CII+CIII를 사용하여 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀의 존재를 연구하는 비교 분석을 기술한다.

Abstract

내부 미토콘드리아 막 (IMM)의 유비퀴논 (CoQ) 풀은 부분적으로 복합체 I 또는 FAD 의존성 효소로 분할된다. 이러한 세분은 동결-해동된 미토콘드리아에서 전자 공여체로서 NADH 또는 숙시네이트를 사용하는 비교 검정에 의해 용이하게 평가될 수 있으며, 여기서 시토크롬 c(cyt c) 감소가 측정된다. 이 분석은 IMM에 대한 Na+의 효과에 의존하여 유동성을 감소시킵니다. 여기에서, NaCl 또는 KCl의 존재 하에서 NADH-cyt c 산화환원효소 활성 및 숙시네이트-cyt c 산화환원효소 활성을 측정하기 위한 프로토콜을 제시한다. 단계적으로 큐벳 내의 시약의 혼합물에 의존하는 반응은 Na+ 또는 K+의 존재하에 4분 동안 분광광도법으로 측정된다. 동일한 혼합물은 흡광도의 비특이적 변화를 뺄 수 있도록 특정 효소 억제제의 존재 하에 병렬로 수행된다. NADH-cyt c 산화환원효소 활성은 이들 양이온 중 임의의 존재하에서 감소하지 않는다. 그러나, 숙시네이트-cyt c 옥시도리덕타제 활성은 NaCl의 존재하에서 감소한다. 이 간단한 실험은 다음을 강조합니다 : 1) IMM 유동성 및 CoQ 전달을 감소시키는 Na +의 효과; 2) 초복합 I+III2가 유비퀴논(CoQ) 전달이 IMM 유동성을 저하시킴으로써 영향을 받지 않도록 보호한다는 것; 3) CII와 CIII 사이의 CoQ 전송이 CII와 CIII 사이의 CoQ 전달과 기능적으로 다르다는 것. 이러한 사실은 IMM에서 기능적으로 차별화 된 CoQ 풀의 존재를 뒷받침하며 미토콘드리아의 변화하는 Na + 환경에 의해 조절 될 수 있음을 보여줍니다.

Introduction

미토콘드리아 산화 인산화 시스템 (OXPHOS)은 미토콘드리아에 의한 아데노신 트리포스페이트 (ATP) 합성, 반응성 산소 종 (ROS) 생산, 및 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오타이드 (NADH) 또는 숙시네이트와 같은 환원 등가물의 소비를 유도하는 주요 경로이다. OXPHOS 시스템은 다섯 가지 단백질 복합체로 구성됩니다 : 복합체 I (CI)는 NADH를 산화시키고 CoQ를 유비퀴놀 (CoQH2)로 환원시킵니다. 콤플렉스 II (CII)는 숙시네이트를 푸마레이트로 산화시키고 CoQ를 CoQH2로 환원시킵니다. 콤플렉스 III (CIII)은 CoQH2를 다시 CoQ로 산화시켜 시토크롬 c (cyt c)를 감소시킵니다. 마지막으로, 복합 IV (CIV)는 cyt c를 산화시키고 산소를 물로 감소시킵니다. 이른바 전자 수송 사슬(mETC)이라고 불리는 이 산화환원 사슬은 IMM을 가로질러 H+의 펌핑에 결합되며, 이는 아데노신 디포스페이트(ADP)를 ATP로 인산화시키기 위해 복합 V(CV)에 의해 사용되는 전기화학적 구배를 생성한다.

mETC 복합체는 IMM에서 단독으로 있거나 수퍼 콤플렉스라는 사차 구조로 조립 될 수 있습니다. CIV는 CIII와 함께 조립하여III2+IV 또는 Q-레스피라솜(CoQH2의 존재하에 호흡할 수 있기 때문에)1,2,3을 형성하거나 동종이량체 또는 호모올리고머(4)를 형성할 수 있다. CIII는 CI와 상호 작용하여 초복합체 I+III25를 형성할 수 있다. 마지막으로, CI는 또한 Q-respirasome과 상호 작용하여 I + III2 + IV 또는 N- 스피라솜 (NADH 소모를 호흡 할 수 있음) 1,6,7,8,9,10을 구축 할 수 있습니다.

CoQ와 cyt c는 각각 CI/CII에서 CIII로, CIII에서 CIV로 전자를 전달하는 역할을 하는 이동 전자 운반체입니다. 초복합체가 이들 담체에 대해 기능적 국부적 제한을 부과하는지 여부는 지난 20년간 2,7,11,12,13,14,15,16,17 동안 격렬한 논쟁의 문제였다. 그러나 몇몇 독립 그룹은 CoQ 및 cyt c가 IMM의 풀로 기능적으로 분할 될 수 있음을 입증했습니다. CoQ와 관련하여, 기능적으로 CI (CoQ NAD)에 대한 특정 CoQ 풀과 FAD 의존성 효소 (CoQFAD)1,7,12,18,19에 전념하는 또 다른 풀로 분할될 수 있다. 그러나, 부분적으로 분절된 기능적 CoQ 풀의 존재를 분화시키기 위해, 대체 옥시다제(AOX)의 과발현 및 CIII의 부재 하에 CI를 조립할 수 있는 특정 mtDNA 돌연변이체의 생성은 1,19,20개가 요구되었다.

저산소증 동안 반응성 산소 종 (ROS) 생산의 메커니즘은 최근까지 알려지지 않았다. 급성 저산소증시, CI는 활성/비활성(A/D) 전이를 겪는데, 이는 H+ 펌핑 NADH-CoQ 산화환원효소 활성의 감소를 수반한다. 이러한 H+ 펌핑의 감소는 미토콘드리아 매트릭스를 산성화시키고 미토콘드리아 매트릭스에 칼슘-포스페이트 침전물을 부분적으로 용해시켜 가용성Ca2+를 방출한다. 가용성Ca2+의 이러한 증가는 Na+/Ca2+ 교환기(NCLX)를 활성화시키며, 이는 Na+와 교환하여Ca2+를 밀어낸다. 미토콘드리아 Na+ 증가는 IMM의 내측에서 인지질과 상호작용하여 CII와 CIII 사이의 유동성 및 CoQ 전달을 감소시키고, 최종적으로 산화환원 신호(21)인 슈퍼옥사이드 음이온을 생성한다. 흥미롭게도, CoQ 전달은 CII와 CIII 사이에서만 감소되었지만 CI와 CIII 사이에는 감소하지 않았으며, 1) Na+는 미토콘드리아의 기존 CoQ 풀 중 하나만 변조 할 수 있었다는 것을 강조했다. 2) IMM에는 기능적으로 차별화된 CoQ 풀이 존재한다. 따라서, 미토콘드리아 효소 활성의 연구를 위해 널리 사용되는 프로토콜이 언급된 CoQ 풀의 존재를 평가하는데 사용될 수 있다.

현재의 프로토콜은 숙시네이트 (즉, CII 기질) 또는 NADH (즉, CI 기질)의 존재 하에서의 흡광도에 의한 CIII의 기질인 산화된 cyt c의 환원의 측정에 기초한다. 동일한 샘플은 두 개로 나뉘며, 그 중 하나는 KCl로 처리되고 다른 하나는 동일한 농도의 NaCl로 처리됩니다. 이런 식으로, Na+가 IMM 유동성을 감소시킨다는 점을 감안할 때, CoQ가 IMM의 고유한 풀에 존재한다면, CI+CIII와 CII+CIII 둘 다 Na+의 존재하에서 감소할 것이다. 그러나 CoQ가 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀에 존재한다면, Na+의 효과는 CII+CIII 활성에 대해 대부분 (또는 만) 명백할 것이지만, CI+CIII에는 미치지 못할 것이다. 최근 발표된21과 같이 Na+는 CII와 CIII 간의 CoQ 전달에만 영향을 미치지만(그림 1C,D), CI와 CIII 간에는 영향을 미치지 않습니다(그림 1A,B).

이 프로토콜은, 기술의 파노플리와 함께, IMM에서 부분적으로 분할된 기능적 CoQ 풀의 존재를 확인하는데 사용되어왔으며, 하나는 CI (즉, CoQ NAD)에 전용이고, 다른 하나는FAD 결합 효소 (즉, CoQFAD)에 전념한다 1,3,7; 22 번 논의가 계속되고 있지만 여러 그룹 7,19에 의해 독립적으로 확증되었다는 관찰. 따라서, CI를 초복합체로 수퍼 어셈블리하는 것은 CoQ의 로컬 이동성에 영향을 미치며, 초복합체1,7,13,14,23,24,25 내에서 CIII에 의한 사용을 용이하게 한다.

Protocol

모든 동물 실험은 실험실 동물의 관리 및 사용 가이드에 따라 수행되었으며 2010년 9월 22일 유럽 연합 지침(2010/63/UE)과 2013년 2월 1일(53/2013)의 스페인 왕실 법령에 따라 스페인 Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares Carlos III(CNIC)의 기관 윤리위원회의 승인을 받았습니다. 사용 된 동물의 수와 고통을 최소화하기 위해 모든 노력을 기울였습니다. 참고: 미토콘드리아 CoQ 풀의 세분?…

Representative Results

이 프로토콜의 일반적인 결과는 아래에 나와 있습니다(그림 3). 감소된 cyt c 흡광도가 550 nm에서 위치함에 따라, 억제되지 않은 모든 서브샘플은 550 nm에서 흡광도의 증가를 보여줘야 한다. 억제된 서브샘플은 이상적으로 평탄한 선 또는 약간 증가하는 기울기를 보여준다(그림 3). 억제된 하위샘플로부터의 기울기는 억제되지 않은 서브샘플로부터 차감되…

Discussion

이 프로토콜은 부분적으로 분할된 CoQ 풀의 존재를 식별하는 매우 간단한 절차이지만, 고려해야 할 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 기질 (즉, NADH 또는 숙시네이트)은 바람직하게는 이들 화합물의 자가산화가 발생할 수 있기 때문에 마지막으로 첨가된다. Cuvette의 뒤집기는 독서를 방해 할 수있는 거품의 형성을 피하기 위해주의해야합니다.

또한, 본 기술은 언급할 가치가 있?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

기술 지원을 위해 R. Martínez-de-Mena 박사, M. M. Muñoz-Hernandez, A., C. Jimenez 박사 및 E. R. Martínez-Jimenez 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 MICIN: RTI2018-099357-B-I00 및 HFSP (RGP0016/2018)에 의해 지원되었다. CNIC는 Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) 및 Pro CNIC Foundation의 지원을 받으며 Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505)입니다. 그림 2는 BioRender.com 로 만들었습니다.

Materials

Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich 10775835001
Bradford protein assay Bio-Rad 5000001
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C7752
K2HPO4 Sigma-Aldrich P3786
KCl Sigma-Aldrich P3911
Malonic acid Sigma-Aldrich M1296
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NADH Roche 10107735001
Potassium cyanide Sigma-Aldrich 207810
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
Spectra Manager software JASCO version 2
Spectrophotometer UV/VISJASCO
Succinate Sigma-Aldrich 398055
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Riferimenti

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Hernansanz-Agustín, P., Enríquez, J. A. Inner Mitochondrial Membrane Sensitivity to Na+ Reveals Partially Segmented Functional CoQ Pools. J. Vis. Exp. (185), e63729, doi:10.3791/63729 (2022).
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