Indre mitokondriemembranfølsomhet overfor Na+ avslører delvis segmenterte funksjonelle coq-bassenger
Summary
Denne protokollen beskriver en komparativ analyse, ved hjelp av mitokondrie komplekse aktiviteter CI + CIII og CII + CIII i nærvær eller fravær av Na +, for å studere eksistensen av delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger.
Abstract
Ubiquinone (CoQ) bassenger i den indre mitokondriemembranen (IMM) er delvis segmentert til enten komplekse I- eller FAD-avhengige enzymer. Slike underavdelinger kan enkelt vurderes ved en komparativ analyse ved hjelp av NADH eller succinat som elektrondonorer i frosne mitokondrier, der cytokrom c (cyt c) reduksjon måles. Analysen er avhengig av effekten av Na+ på IMM, og reduserer flyten. Her presenterer vi en protokoll for å måle NADH-cyt c oxidoreductase aktivitet og succinate-cyt c oxidoreductase aktiviteter i nærvær av NaCl eller KCl. Reaksjonene, som er avhengige av blandingen av reagenser i en cuvette på en trinnvis måte, måles spektrofotometrisk i løpet av 4 minutter i nærvær av Na + eller K +. Den samme blandingen utføres parallelt i nærvær av de spesifikke enzymhemmerne for å trekke fra den uspesifiserte endringen i absorbans. NADH-cyt c oxidoreductase aktivitet reduseres ikke i nærvær av noen av disse kasjonene. Imidlertid reduseres succinate-cyt c oxidoreductase aktiviteten i nærvær av NaCl. Dette enkle eksperimentet fremhever: 1) effekten av Na + i avtagende IMM-fluiditet og CoQ-overføring; 2) at supercomplex I +III2 beskytter ubiquinone (CoQ) overføring fra å bli påvirket av å senke IMM-fluiditet; 3) at CoQ overføring mellom CI og CIII er funksjonelt forskjellig fra CoQ overføring mellom CII og CIII. Disse fakta støtter eksistensen av funksjonelt differensierte CoQ-bassenger i IMM og viser at de kan reguleres av det skiftende Na + -miljøet i mitokondrier.
Introduction
Mitokondrie oksidativt fosforyleringssystem (OXPHOS) er hovedveien som driver adenosintrifosfat (ATP) syntese, reaktiv oksygenart (ROS) produksjon, og forbruk av redusere ekvivalenter, som nikotinamid adenin dinucleotide (NADH) eller succinat, av mitokondrier. OXPHOS-systemet består av fem proteinkomplekser: Kompleks I (CI) oksiderer NADH og reduserer CoQ til ubiquinol (CoQH2). Kompleks II (CII) oksiderer succinat til fumarat og reduserer CoQ til CoQH2. Kompleks III (CIII) oksiderer CoQH2 tilbake til CoQ, noe som reduserer cytokrom c (cyt c). Til slutt oksiderer komplekse IV (CIV) cyt c og reduserer oksygen til vann. Denne oksidoreduksjonskjeden, den såkalte elektrontransportkjeden (mETC), er koblet til pumping av H+ over IMM, noe som skaper en elektrokjemisk gradient som brukes av kompleks V (CV) til fosforylat adenosindifosfat (ADP) til ATP.
mETC-komplekser kan enten være alene i IMM eller samles i kvartære strukturer kalt superkompatibiliteter. CIV kan samles med CIII, danner III2 +IV eller Q-respirasome (som det er i stand til å respirere i nærvær av CoQH2)1,2,3 eller danner homodimers eller homooligomerer4. CIII kan samhandle med CI, og danner supercomplex I +III25. Til slutt er CI også i stand til å samhandle med Q-respirasome, bygge I + III2 + IV eller N-respirasome (som det kan respirere forbruker NADH) 1,6,7,8,9,10.
CoQ og cyt c er mobile elektronbærere som har ansvaret for å overføre elektroner fra CI / CII til CIII, og fra CIII til CIV, henholdsvis. Hvorvidt supercomplexes pålegger en funksjonell lokal begrensning for disse transportørene har vært et spørsmål om intens debatt gjennom de siste to tiårene 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Flere uavhengige grupper har imidlertid vist at CoQ og cyt c kan segmenteres funksjonelt i bassenger i IMM. Når det gjelder CoQ, kan den segmenteres funksjonelt i et spesifikt CoQ-basseng for CI (CoQNAD) og et annet basseng dedikert til FAD-avhengige enzymer (CoQFAD)1,7,12,18,19. For å skille mellom eksistensen av delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger, var imidlertid overekspressionen av den alternative oksidasen (AOX) og generasjonen av spesifikke mtDNA-mutanter, som kan montere CI i fravær av CIII, nødvendig 1,19,20.
Mekanismen for reaktiv oksygenart (ROS) produksjon under hypoksi var ukjent inntil nylig. Ved akutt hypoksi gjennomgår CI den aktive/deaktiveringsovergangen (A/D), som innebærer reduksjonen i H+ pumping av NADH-CoQ oksidoreductaseaktivitet. En slik reduksjon i H + pumping syrer mitokondriematrisen og oppløser delvis kalsiumfosfatutfellingene i mitokondriematrisen, og frigjør løselig Ca2 +. Denne økningen i løselig Ca2+ aktiverer Na +/Ca2+ veksler (NCLX), som ekstruderer Ca2+ i bytte mot Na+. Mitokondrie Na + økning samhandler med fosfolipider på innsiden av IMM, reduserer fluiditeten og CoQ-overføringen mellom CII og CIII, og produserer til slutt superoksidanion, et redokssignal21. Interessant nok ble CoQ-overføringen bare redusert mellom CII og CIII, men ikke mellom CI og CIII, og fremhevet at 1) Na + bare var i stand til å modulere ett av de eksisterende CoQ-bassengene i mitokondriene; 2) det finnes funksjonelt differensierte CoQ-bassenger i IMM. Dermed kan en mye brukt protokoll for studiet av mitokondrie enzymaktiviteter brukes til å vurdere eksistensen av de nevnte CoQ-bassengene.
Den nåværende protokollen er basert på måling av reduksjon av oksidert cyt c, substratet til CIII, ved absorbans i nærvær av succinat (dvs. CII substrat) eller NADH (dvs. CI-substrat). Den samme prøven er delt inn i to, hvorav den ene vil bli behandlet med KCl, og den andre med samme konsentrasjon av NaCl. På denne måten, gitt at Na + reduserer IMM-fluiditeten, hvis CoQ eksisterte i et unikt basseng i IMM, ville både CI + CIII og CII + CIII reduseres i nærvær av Na +. Imidlertid, hvis CoQ eksisterte i delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger, ville effekten av Na + for det meste (eller bare) være tydelig på CII + CIII-aktiviteten, men ikke på CI + CIII. Som nylig publisert21, påvirker Na + bare CoQ-overføringen mellom CII og CIII (figur 1C, D), men ikke mellom CI og CIII (figur 1A, B).
Denne protokollen, sammen med en panoply av teknikker, har blitt brukt til å bekrefte eksistensen av delvis segmenterte funksjonelle CoQ-bassenger i IMM, en dedikert til CI (dvs. CoQNAD), og en annen dedikert til FAD-tilknyttede enzymer (dvs. CoQFAD) 1,3,7; en observasjon om at selv om det fortsatt er debattert22, har blitt bekreftet uavhengig av flere grupper 7,19. Dermed påvirker supermonteringen av CI i superkompatibiliteter den lokale mobiliteten til CoQ, noe som letter bruken av CIII innenfor supercomplex 1,7,13,14,23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om denne protokollen representerer en veldig grei prosedyre for å identifisere eksistensen av de delvis segmenterte CoQ-bassengene, er det noen få kritiske trinn å ta hensyn til. Substrater (dvs. NADH eller succinate) tilsettes fortrinnsvis sist siden autooksidasjon av disse forbindelsene kan forekomme. Cuvettes flipping må være forsiktig for å unngå dannelse av bobler som kan forstyrre avlesningen.
I tillegg presenterer den nåværende teknikken noen begrensninger som er verdt å …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernandez, A., Dr. Jimenez og E. R. Martínez-Jimenez for teknisk assistanse. Denne studien ble støttet av MICIN: RTI2018-099357-B-I00 og HFSP (RGP0016/2018). CNIC støttes av Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) og Pro CNIC Foundation og er et Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505). Figur 2 opprettet med BioRender.com.
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
Riferimenti
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830 (2020).
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
