La sensibilidad de la membrana mitocondrial interna al Na+ revela grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados
Summary
Este protocolo describe un ensayo comparativo, utilizando actividades complejas mitocondriales CI+CIII y CII+CIII en presencia o ausencia de Na+, para estudiar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados.
Abstract
Las piscinas de ubiquinona (CoQ) en la membrana mitocondrial interna (IMM) están parcialmente segmentadas en enzimas complejas I o dependientes de FAD. Dicha subdivisión puede evaluarse fácilmente mediante un ensayo comparativo utilizando NADH o succinato como donantes de electrones en mitocondrias congeladas-descongeladas, en las que se mide la reducción del citocromo c (cyt c). El ensayo se basa en el efecto de Na+ sobre el IMM, disminuyendo su fluidez. Aquí, presentamos un protocolo para medir la actividad de la NADH-cyt c oxidorreductasa y las actividades de la succinato-cyt c oxidorreductasa en presencia de NaCl o KCl. Las reacciones, que se basan en la mezcla de reactivos en una cubeta de manera escalonada, se miden espectrofotométricamente durante 4 min en presencia de Na+ o K+. La misma mezcla se realiza en paralelo en presencia de inhibidores enzimáticos específicos para restar el cambio inespecífico en la absorbancia. La actividad de la NADH-cyt c oxidorreductasa no disminuye en presencia de ninguno de estos cationes. Sin embargo, la actividad de la oxidorreductasa de succinato-cyt c disminuye en presencia de NaCl. Este sencillo experimento destaca: 1) el efecto del Na+ en la disminución de la fluidez de la IMM y la transferencia de CoQ; 2) que el supercomplejo I + III2 protege la transferencia de ubiquinona (CoQ) de verse afectada por la disminución de la fluidez de IMM; 3) que la transferencia de CoQ entre IC y CIII es funcionalmente diferente de la transferencia de CoQ entre CII y CIII. Estos hechos apoyan la existencia de grupos de CoQ funcionalmente diferenciados en el IMM y muestran que pueden ser regulados por el entorno cambiante de Na + de las mitocondrias.
Introduction
El sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) es la principal vía que impulsa la síntesis de trifosfato de adenosina (ATP), la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el consumo de equivalentes reductores, como nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) o succinato, por parte de las mitocondrias. El sistema OXPHOS se compone de cinco complejos de proteínas: el Complejo I (CI) oxida el NADH y reduce la CoQ en ubiquinol (CoQH2). El Complejo II (CII) oxida el succinato en fumarato y reduce la CoQ en CoQH2. El Complejo III (CIII) oxida la CoQH2 de nuevo en CoQ, reduciendo el citocromo c (cyt c). Finalmente, el complejo IV (CIV) oxida el citt c y reduce el oxígeno al agua. Esta cadena de oxidorreducción, la llamada cadena de transporte de electrones (mETC), está acoplada al bombeo de H + a través de la IMM, lo que crea un gradiente electroquímico utilizado por el complejo V (CV) para fosforilar el difosfato de adenosina (ADP) en ATP.
Los complejos mETC pueden estar solos en el IMM o ensamblarse en estructuras cuaternarias llamadas supercomplejos. El CIV puede ensamblarse con CIII, formando el III2+IV o Q-respirasoma (ya que es capaz de respirar en presencia de CoQH2)1,2,3 o formando homodímeros u homooligomeros4. CIII puede interactuar con CI, formando el supercomplejo I+III25. Finalmente, CI también es capaz de interactuar con el Q-respirasoma, construyendo el I+III2+IV o N-respirasoma (ya que puede respirar consumiendo NADH)1,6,7,8,9,10.
CoQ y cyt c son portadores de electrones móviles encargados de transferir electrones de CI/CII a CIII, y de CIII a CIV, respectivamente. Si los supercomplejos imponen o no una restricción local funcional para estos portadores ha sido un tema de intenso debate a lo largo de las últimas dos décadas 2,7,11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, varios grupos independientes han demostrado que coQ y cyt c se pueden segmentar funcionalmente en grupos en el IMM. Con respecto a la CoQ, se puede segmentar funcionalmente en una agrupación específica de CoQ para IC (CoQNAD) y otra agrupación dedicada a enzimas dependientes de FAD (CoQFAD)1,7,12,18,19. Sin embargo, para diferenciar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados, se requirió la sobreexpresión de la oxidasa alternativa (AOX) y la generación de mutantes específicos de ADNmt, que pueden ensamblar IC en ausencia de CIII, 1,19,20.
El mecanismo de producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) durante la hipoxia era desconocido hasta hace poco. Ante la hipoxia aguda, IC sufre la transición activa/deactiva (A/D), que implica la disminución de su actividad de bombeo H+ NADH-CoQ oxidorreductasa. Tal disminución en el bombeo de H + acidifica la matriz mitocondrial y disuelve parcialmente los precipitados de calcio-fosfato en la matriz mitocondrial, liberando Ca2 + soluble. Este aumento de Ca2+ soluble activa el intercambiador Na+/Ca2+ (NCLX), que extruye Ca2+ a cambio de Na+. El aumento de Na+ mitocondrial interactúa con los fosfolípidos en el lado interno de la IMM, disminuyendo su fluidez y transferencia de CoQ entre CII y CIII, produciendo finalmente anión superóxido, una señal redox21. Curiosamente, la transferencia de CoQ solo disminuyó entre CII y CIII, pero no entre IC y CIII, destacando que 1) Na+ fue capaz de modular solo uno de los grupos de CoQ existentes en las mitocondrias; 2) existen grupos de CoQ funcionalmente diferenciados en el IMM. Por lo tanto, se puede utilizar un protocolo ampliamente utilizado para el estudio de las actividades enzimáticas mitocondriales para evaluar la existencia de las piscinas de CoQ mencionadas.
El protocolo actual se basa en la medición de la reducción de la cit c oxidada, el sustrato de CIII, por absorbancia en presencia de succinato (es decir, sustrato CII) o NADH (es decir, sustrato CI). La misma muestra se divide en dos, una de las cuales será tratada con KCl, y la otra con la misma concentración de NaCl. De esta manera, dado que el Na+ disminuye la fluidez de la IMM, si la CoQ existiera en un pool único en la IMM, tanto la CI+CIII como la CII+CIII disminuirían en presencia de Na+. Sin embargo, si la CoQ existiera en grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados, el efecto de Na+ sería mayormente (o sólo) evidente en la actividad de CII+CIII, pero no en la CI+CIII. Como se publicó recientemente21, na+ solo afecta la transferencia de CoQ entre CII y CIII (Figura 1C,D), pero no entre IC y CIII (Figura 1A,B).
Este protocolo, junto con una panoplia de técnicas, se ha utilizado para confirmar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados en el IMM, uno dedicado a CI (es decir, CoQNAD) y otro dedicado a enzimas ligadas a FAD (es decir, CoQFAD)1,3,7; una observación que, aunque se sigue debatiendo22, ha sido corroborada de forma independiente por varios grupos 7,19. Así, el superasamblaje de IC en supercomplejos impacta en la movilidad local de CoQ, facilitando su uso por el CIII dentro del supercomplejo 1,7,13,14,23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque este protocolo representa un procedimiento muy sencillo para identificar la existencia de los grupos de CoQ parcialmente segmentados, hay algunos pasos críticos a tener en cuenta. Los sustratos (es decir, NADH o succinato) se agregan preferiblemente en último lugar, ya que puede ocurrir la autooxidación de estos compuestos. El volteo de cuvette debe ser cuidadoso para evitar la formación de burbujas que puedan interferir con la lectura.
Además, la presente técnica presenta algunas…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Dr. R. Martínez-de-Mena, M. M. Muñoz-Hernández, A., al Dr. C. Jiménez y al E. R. Martínez-Jiménez por su asistencia técnica. Este estudio fue apoyado por MICIN: RTI2018-099357-B-I00 y HFSP (RGP0016/2018). El CNIC cuenta con el apoyo del Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), el Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades (MCNU) y la Fundación Pro CNIC y es un Centro de Excelencia Severo Ochoa (SEV-2015-0505). Figura 2 creada con BioRender.com.
Materials
| Antimycin A | Sigma-Aldrich | A8674 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | 10775835001 | |
| Bradford protein assay | Bio-Rad | 5000001 | |
| Cytochrome c from equine heart | Sigma-Aldrich | C7752 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldrich | P3786 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| Malonic acid | Sigma-Aldrich | M1296 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NADH | Roche | 10107735001 | |
| Potassium cyanide | Sigma-Aldrich | 207810 | |
| Rotenone | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| Spectra Manager software | JASCO | version 2 | |
| Spectrophotometer | UV/VISJASCO | ||
| Succinate | Sigma-Aldrich | 398055 |
Riferimenti
- Calvo, E., et al. Functional role of respiratory supercomplexes in mice: SCAF1 relevance and segmentation of the Qpool. Science Advances. 6 (26), (2020).
- Garcia-Poyatos, C., et al. Scaf1 promotes respiratory supercomplexes and metabolic efficiency in zebrafish. EMBO Reports. 21 (7), 50287 (2020).
- Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
- Cogliati, S., et al. Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV. Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Degliesposti, G., Skehel, M., Sazanov, L. A. Structures of respiratory Supercomplex I+III2 reveal functional and conformational crosstalk. Molecular Cell. 75 (6), 1131-1146 (2019).
- Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular Cell. 32 (4), 529-539 (2008).
- Jeon, T. J., et al. A dynamic substrate pool revealed by cryo-EM of a lipid-preserved respiratory supercomplex. Antioxidants and Redox Signaling. , (2021).
- Gu, J., et al. The architecture of the mammalian respirasome. Nature. 537 (7622), 639-643 (2016).
- Letts, J. A., Fiedorczuk, K., Sazanov, L. A. The architecture of respiratory supercomplexes. Nature. 537 (7622), 644-648 (2016).
- Sousa, J. S., Mills, D. J., Vonck, J., Kuhlbrandt, W. Functional asymmetry and electron flow in the bovine respirasome. Elife. 5, 21290 (2016).
- Andreasson, C., Ott, M., Buttner, S. Mitochondria orchestrate proteostatic and metabolic stress responses. EMBO Reports. 20 (10), 47865 (2019).
- Berndtsson, J., et al. Respiratory supercomplexes enhance electron transport by decreasing cytochrome c diffusion distance. EMBO Reports. 21 (12), 51015 (2020).
- Bianchi, C., Genova, M. L., Parenti Castelli, G., Lenaz, G. The mitochondrial respiratory chain is partially organized in a supercomplex assembly: kinetic evidence using flux control analysis. Journal of Biological Chemistry. 279 (35), 36562-36569 (2004).
- Enriquez, J. A. Supramolecular organization of respiratory complexes. Annual Review of Physiology. 78, 533-561 (2016).
- Genova, M. L., Lenaz, G. A critical appraisal of the role of respiratory supercomplexes in mitochondria. Biological Chemistry. 394 (5), 631-639 (2013).
- Letts, J. A., Sazanov, L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain. Nature Structural and Molecular Biology. 24 (10), 800-808 (2017).
- Milenkovic, D., Blaza, J. N., Larsson, N. G., Hirst, J. The enigma of the respiratory chain supercomplex. Cell Metabolism. 25 (4), 765-776 (2017).
- Moe, A., Di Trani, J., Rubinstein, J. L., Brzezinski, P. Cryo-EM structure and kinetics reveal electron transfer by 2D diffusion of cytochrome c in the yeast III-IV respiratory supercomplex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), 2021157118 (2021).
- Szibor, M., et al. Bioenergetic consequences from xenotopic expression of a tunicate AOX in mouse mitochondria: Switch from RET and ROS to FET. Biochimica et Biophysica Acta. Bioenergetics. 1861 (2), 148137 (2020).
- Guaras, A., et al. The CoQH2/CoQ ratio serves as a sensor of respiratory chain efficiency. Cell Reports. 15 (1), 197-209 (2016).
- Hernansanz-Agustin, P., et al. Na(+) controls hypoxic signalling by the mitochondrial respiratory chain. Nature. 586 (7828), 287-291 (2020).
- Vercellino, I., Sazanov, L. A. The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 23 (2), 141-161 (2022).
- Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model. Biochimica et Biophysica Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).
- Enriquez, J. A., Lenaz, G. Coenzyme q and the respiratory chain: coenzyme q pool and mitochondrial supercomplexes. Molecular Syndromology. 5 (3-4), 119-140 (2014).
- Hernansanz-Agustin, P., Enriquez, J. A. Functional segmentation of CoQ and cyt c pools by respiratory complex superassembly. Free Radical Biology and Medicine. 167, 232-242 (2021).
- Fernandez-Vizarra, E., et al. Isolation of mitochondria for biogenetical studies: An update. Mitochondrion. 10 (3), 253-262 (2010).
- Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes. Biochemical Society Transactions. 49 (6), 2655-2668 (2021).
- den Brave, F., Becker, T. Supercomplex formation boosts respiration. EMBO Reports. 21 (12), 51830 (2020).
- Perez-Mejias, G., Guerra-Castellano, A., Diaz-Quintana, A., Dela Rosa, M. A., Diaz-Moreno, I. Cytochrome c: Surfing off of the mitochondrial membrane on the tops of Complexes III and IV. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 654-660 (2019).
- Stepanova, A., Valls, A., Galkin, A. Effect of monovalent cations on the kinetics of hypoxic conformational change of mitochondrial complex I. Biochimica et Biophysica Acta. 1847 (10), 1085-1092 (2015).
- Acin-Perez, R., et al. A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples. The EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).
- Böckmann, R. A., Hac, A., Heimburg, T., Grubmüller, H. Effect of sodium chloride on a lipid bilayer. Biophysical Journal. 85 (3), 1647-1655 (2003).
- Cordomí, A., Edholm, O., Perez, J. J. Effect of ions on a dipalmitoyl phosphatidylcholine bilayer. a molecular dynamics simulation study. The Journal of Physical Chemistry B. 112 (5), 1397-1408 (2008).
