Fabrikasjon av mikromønstret chip med kontrollert tykkelse for kryogen elektronmikroskopi med høy gjennomstrømning

Summary

En nyutviklet mikromønstret brikke med grafenoksidvinduer fremstilles ved å bruke mikroelektromekaniske systemteknikker, noe som muliggjør effektiv og høy gjennomstrømning kryogen elektronmikroskopiavbildning av forskjellige biomolekyler og nanomaterialer.

Abstract

En stor begrensning for effektiv strukturanalyse med høy gjennomstrømning av biomolekyler ved bruk av kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er vanskeligheten med å forberede kryo-EM-prøver med kontrollert istykkelse på nanoskala. Den silisiumbaserte (Si) -baserte brikken, som har et vanlig utvalg av mikrohull med grafenoksid (GO) vindu mønstret på en tykkelsesstyrt silisiumnitrid (Si_xN_y) film, er utviklet ved å bruke mikroelektromekaniske system (MEMS) teknikker. UV-fotolitografi, kjemisk dampavsetning, våt og tørr etsning av tynnfilmen og dråpestøping av 2D nanoarkmaterialer ble brukt til masseproduksjon av mikromønstrede sjetonger med GO-vinduer. Dybden på mikrohullene reguleres for å kontrollere istykkelsen på forespørsel, avhengig av størrelsen på prøven for kryo-EM-analyse. Den gunstige affiniteten til GO mot biomolekyler konsentrerer biomolekylene av interesse i mikrohullet under kryo-EM-prøvepreparering. Den mikromønstrede brikken med GO-vinduer muliggjør kryo-EM-avbildning med høy gjennomstrømning av ulike biologiske molekyler, samt uorganiske nanomaterialer.

Introduction

Kryogen elektronmikroskopi (cryo-EM) er utviklet for å løse den tredimensjonale (3D) strukturen til proteiner i deres opprinnelige tilstand 1,2,3,4. Teknikken innebærer å feste proteiner i et tynt lag (10-100 nm) av glassaktig is og skaffe projeksjonsbilder av tilfeldig orienterte proteiner ved hjelp av et transmisjonselektronmikroskop (TEM), med prøven opprettholdt ved flytende nitrogentemperatur. Tusenvis til millioner av projeksjonsbilder er anskaffet og brukes til å rekonstruere en 3D-struktur av proteinet ved hjelp av beregningsalgoritmer ^5,6. For vellykket analyse med cryo-EM, har kryoprøvepreparering blitt automatisert ved å stupfryse utstyret som styrer blottingforholdene, fuktigheten og temperaturen. Prøveløsningen lastes på et TEM-rutenett med en hullete karbonmembran, sempes suksessivt for å fjerne overflødig løsning, og deretter stupfryses med flytende etan for å produsere tynn, glassaktig is ^1,5,6. Med fremskrittene innen kryo-EM og automatiseringen av prøvepreparering⁷, har kryo-EM i økende grad blitt brukt til å løse strukturen til proteiner, inkludert konvoluttproteiner for virus og ionekanalproteiner i cellemembranen ^8,9,10. Strukturen av konvoluttproteiner av patogene viruspartikler er viktig for å forstå virusinfeksjonspatologi, samt utvikle diagnosesystemet og vaksiner som SARS-CoV-2¹¹, som forårsaket COVID-19-pandemien. Videre har kryo-EM-teknikker nylig blitt brukt på materialvitenskap, for eksempel for avbildning av strålefølsomme materialer som brukes i batteri 12,13,14 og katalytiske systemer ^14,15 og analyse av strukturen til uorganiske materialer i løsningstilstand¹⁶.

Til tross for merkbar utvikling i kryo-EM og relevante teknikker, finnes det begrensninger i kryoprøvepreparering, noe som hindrer 3D-strukturanalyse med høy gjennomstrømning. Forberedelse av en glassaktig isfilm med optimal tykkelse er spesielt viktig for å oppnå 3D-strukturen av biologiske materialer med atomoppløsning. Isen må være tynn nok til å minimere bakgrunnsstøy fra elektroner spredt av isen og for å forby overlapping av biomolekyler langs elektronstrålebanen ^1,17. Men hvis isen er for tynn, kan det føre til at proteinmolekyler justerer seg i foretrukne retninger eller denaturerer 18,19,20. Derfor bør tykkelsen på glassaktig is optimaliseres avhengig av størrelsen på materialet av interesse. Videre er det vanligvis behov for omfattende innsats for prøvepreparering og manuell screening av is- og proteinintegritet på de forberedte TEM-nettene. Denne prosessen er ekstremt tidkrevende, noe som hindrer effektiviteten for 3D-strukturanalyse med høy gjennomstrømning. Derfor vil forbedringer i påliteligheten og reproduserbarheten av kryo-EM prøvepreparering øke bruken av kryo-EM i strukturbiologi og kommersiell legemiddeloppdagelse, så vel som for materialvitenskap.

Her introduserer vi mikrofabrikasjonsprosesser for å lage en mikromønstret chip med grafenoksid (GO) vinduer designet for høy gjennomstrømning kryo-EM med kontrollert istykkelse²¹. Den mikromønstrede brikken ble produsert ved hjelp av mikroelektromekaniske systemteknikker (MEMS), som kan manipulere strukturen og dimensjonene til brikken avhengig av bildebehandlingsformålene. Den mikromønstrede brikken med GO-vinduer har en mikrobrønnstruktur som kan fylles med prøveløsningen, og dybden på mikrobrønnen kan reguleres for å kontrollere tykkelsen på glasslegemet. Den sterke affiniteten til GO for biomolekyler forbedrer konsentrasjonen av biomolekyler for visualisering, og forbedrer effektiviteten av strukturanalysen. Videre består den mikromønstrede brikken av en Si-ramme, som gir høy mekanisk stabilitet for rutenettet¹⁹, noe som gjør den ideell for håndtering av brikken under prøveprepareringsprosedyrer og kryo-EM-avbildning. Derfor gir en mikromønstret brikke med GO-vinduer produsert av MEMS-teknikker pålitelighet og reproduserbarhet av kryo-EM-prøvepreparering, noe som kan muliggjøre effektiv strukturanalyse med høy gjennomstrømning basert på cryo-EM.

Protocol

1. Fabrikasjon av mikromønstret chip med GO-vinduer (figur 1) Sett inn silisiumnitridet.Avsett silisiumnitrid med lav spenning (SixNy) på begge sider av Si-waferen (4 tommers diameter og 100 μm tykkelse) ved bruk av lavtrykks kjemisk dampavsetning (LPCVD) ved 830 ° C og et trykk på 150 mTorr, under en strømning på 170 sccm diklorsilan (SiH2Cl2, DCS) og 38 sccm ammoniakk (NH3).</l…

Representative Results

En mikromønstret brikke med GO-vinduer ble produsert av MEMS-fabrikasjon og 2D GO nanoarkoverføring. Chips for mikromønstre ble masseprodusert, med ca 500 chips produsert fra en 4 i wafer (figur 1B og figur 2A, B). Utformingen av de mikromønstrede sjetongene kan manipuleres ved hjelp av forskjellige design av krommasken (figur 2) under fotolitografiprosedyren. De fabrikkerte mikromønstrede sjetongene hadde kont…

Discussion

Mikrofabrikasjonsprosessene for produksjon av mikromønstrede brikker med GO-vinduer blir introdusert her. Den fabrikkerte mikromønstrede brikken er designet for å regulere tykkelsen på glasslegemet ved å kontrollere dybden på mikrohullet med GO-vinduer avhengig av størrelsen på materialet som skal analyseres. En mikromønstret brikke med GO-vinduer ble produsert ved hjelp av en rekke MEMS-teknikker og en 2D nanoarkoverføringsmetode (figur 1). Den største fordelen ved å bruke MEMS-…

Materials

1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP)	Sigma Aldrich, USA	443778
Acetone
AFM	Park Systems, South Korea	NX-10
Aligner	Midas System, South Korea	MDA-600S
AZ 300 MIF developer	AZ Electronic Materials USA Corp., USA	184411
Cryo-EM holder	Gatan, USA	626 single tilt cryo-EM holder
Cryo-plunging machine	Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA	Vitrobot Mark IV
Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM)	FEI Company, USA	Helios NanoLab 650
Glow discharger	Ted Pella Inc., USA	PELCO easiGlow
Graphene oxide (GO) solution	Sigma Aldrich, USA	763705
Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+%	Alfa Aesar, USA	10226590
Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD)	Centrotherm, Germany	LPCVD E1200
maP1205 positive PR	Micro resist technology, Germany	A15139
Potassium hydroxide (KOH), flake	DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea	6597-4400
Raman Spectrometer	NOST, South Korea	Confocal Micro Raman System HEDA
Reactive ion etcher (RIE)	Scientific Engineering, South Korea	Lab-built
SEM	Carl Zeiss, Germany	SUPRA 55VP
Si wafer	JP COMMERCE, South Korea		4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um
Spin coater	Dong Ah Trade Corp., South Korea	ACE-200
TEM	JEOL, Japan	JEM-2100F