せん断力によるアンサンブル力分光法
Summary
アンサンブル力分光法(EFS)は、生物物理学およびバイオセンシング分野における生体分子構造のアンサンブルセットの機械的アンフォールディングおよびリアルタイムセンシングのための堅牢な技術です。
Abstract
蛍光とメカノケミカルの原理に基づく単一分子技術は、生物学的センシングにおいて優れた感度を提供します。しかしながら、高スループット能力の欠如のために、これらの技術の適用は生物物理学において制限されている。アンサンブルフォース分光法(EFS)は、個々の分子のメカノケミカル研究を分子アンサンブルの研究に変換することにより、大量の分子構造の調査において高いスループットを実証しています。このプロトコルでは、DNA二次構造(i-motif)をホモジナイザーチップのローターとステーターの間のせん断流で最大77796/sのせん断速度で展開しました。i-motifが受けるせん断力に対する流量と分子サイズの影響が実証されました。EFS法はまた、DNA iモチーフとリガンドの間の結合親和性を明らかにした。さらに、せん断力によって作動できるクリック化学反応(メカノクリック化学)を実証しました。これらの結果は、せん断力を利用して分子構造の立体構造を制御することの有効性を確立しています。
Introduction
単一分子力分光法1(SMFS)では、原子間力顕微鏡、光ピンセット、磁気ピンセット2,3,4などの高度な機器によって、個々の分子構造の機械的特性が研究されてきました。力の生成/検出セットアップにおける分子の同じ指向性要件、または磁気ピンセットと小型遠心力顕微鏡(MCF)5、6、7、8の小さな視野によって制限されるため、SMFSを使用して同時に調査できる分子の数は限られています。SMFSのスループットが低いため、多数の分子の関与を必要とする分子認識分野での幅広い用途が妨げられています。
せん断流は、分子の大規模なセットに力を加えるための潜在的な解決策を提供します9。流路内部の液体流では、流路表面に近いほど、流量10は遅くなる。このような流速勾配は、境界面に平行なせん断応力を引き起こします。分子がこのせん断流に配置されると、せん断力が長軸11に加えられるため、分子はその長軸が流れ方向と整列するようにそれ自体を再配向する。この再配向の結果として、同じタイプ(ハンドルのサイズと長さ)のすべての分子は、同じせん断力を受けながら同じ方向に整列することが期待されます。
この研究では、このようなせん断流を使用して、DNA i-motifに例示されるように、大量の分子構造にせん断力を加えるプロトコルについて説明しています。このプロトコルでは、ホモジナイザーチップのローターとステーターの間にせん断流が発生します。本研究では、折り畳まれたDNA i-motif構造が9724-97245 s-1のせん断速度で展開できることを見出した。また、L2H2-4OTD配位子とiモチーフの間には36μMの解離定数が見られた。この値は、ゲルシフトアッセイ12によって測定された31μMの値と一致する。さらに、現在の技術を使用してiモチーフを展開し、キレート銅(I)を露出させてクリック反応を触媒することができます。したがって、このプロトコルにより、低コストの機器を使用して大量のi-motif構造を妥当な時間(30分未満)で展開することができます。せん断力法は力分光法のスループットを大幅に向上させることを考えると、この技術をアンサンブル力分光法(EFS)と呼びます。このプロトコルは、このせん断力ベースのEFSの適用を容易にするための実験ガイドラインを提供することを目的としています。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿に記載されているプロトコルは、せん断力による生体分子構造のアンサンブルセットの展開のリアルタイム調査を可能にします。ここで提示された結果は、DNA i-モチーフ構造がせん断力によって展開できることを強調しています。リガンド結合iモチーフの展開とせん断力作動クリック反応は、このアンサンブル力分光法の概念実証アプリケーションでした。
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Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究成果は、米国国立科学財団 [CBET-1904921] および国立衛生研究所 [NIH R01CA236350] の支援を受けました。
Materials
| 3K MWCO Amicon | Millipore Sigma | ufc900324 | |
| Ascorbic acid | VWR | VWRC0143-100G | |
| Calfluor 488 azide | Click Chemistry Tools | 1369-1 | |
| CuCl | Thermo | ACRO270525000 | |
| Dispersion tip | Switzerland | PT-DA07/2EC-B101 | |
| DNA oligos | IDT | ||
| Dye | IDT | /5Cy5/ | |
| Fluorescence microscope | Janpan | Nikon TE2000-U | |
| Homogenizer | Switzerland | PT 3100D | |
| HPG | Santa Cruz Biotechnology | cs-295271 | |
| KCl | VWR | VWRC26760.295 | |
| MES | VWR | VWRCE169-500G | |
| Quencher | IDT | /3IAbRQSp/ | |
| TBTA | Tokyo Chemical Industry | T2993 | |
| Tris | VWR | VWRCE133-100G |
Riferimenti
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