Estabelecimento de Xenoenxertos Derivados de Pacientes com Zebrafish de Câncer de Pâncreas para Teste de Quimiosensibilidade
Summary
Os modelos pré-clínicos visam avançar no conhecimento da biologia do câncer e predizer a eficácia do tratamento. Este trabalho descreve a geração de xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) à base de peixe-zebra com fragmentos de tecido tumoral. Os zPDXs foram tratados com quimioterapia, cujo efeito terapêutico foi avaliado em termos de apoptose celular do tecido transplantado.
Abstract
O câncer é uma das principais causas de morte no mundo, e a incidência de muitos tipos de câncer continua aumentando. Muito se avançou em termos de rastreio, prevenção e tratamento; no entanto, ainda faltam modelos pré-clínicos que predizem o perfil quimiossensível de pacientes com câncer. Para preencher essa lacuna, um modelo de xenoenxerto derivado do paciente in vivo foi desenvolvido e validado. O modelo foi baseado em embriões de zebrafish (Danio rerio) aos 2 dias pós-fecundação, os quais foram utilizados como receptores de fragmentos de xenoenxerto de tecido tumoral retirados da peça cirúrgica de uma paciente.
Vale ressaltar também que as amostras bióticas não foram digeridas ou desagregadas, a fim de manter o microambiente tumoral, o que é crucial para analisar o comportamento tumoral e a resposta à terapia. O protocolo detalha um método para estabelecer xenoenxertos derivados de pacientes (zPDXs) baseados em peixe-zebra a partir da ressecção cirúrgica de tumor sólido primário. Após triagem por um anatomopatologista, o espécime é dissecado com lâmina de bisturi. Tecido necrótico, vasos ou tecido adiposo são removidos e, em seguida, picados em pedaços de 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm.
As peças são então marcadas fluorescentemente e xenotransplantadas para o espaço perivitelino de embriões de peixe-zebra. Um grande número de embriões pode ser processado a baixo custo, permitindo análises in vivo de alto rendimento da quimiossensibilidade de zPDXs a múltiplas drogas anticâncer. Imagens confocais são rotineiramente adquiridas para detectar e quantificar os níveis apoptóticos induzidos pelo tratamento quimioterápico em comparação com o grupo controle. O procedimento de xenoenxerto tem uma vantagem de tempo significativa, uma vez que pode ser concluído em um único dia, proporcionando uma janela de tempo razoável para realizar uma triagem terapêutica para ensaios co-clínicos.
Introduction
Um dos problemas da pesquisa clínica do câncer é que o câncer não é uma doença única, mas uma variedade de doenças diferentes que podem evoluir ao longo do tempo, exigindo tratamentos específicos dependendo das características do próprio tumor e do paciente1. Consequentemente, o desafio é avançar em direção à pesquisa do câncer orientada ao paciente, a fim de identificar novas estratégias personalizadas para a predição precoce dos resultados do tratamento do câncer2. Isso é particularmente relevante para o adenocarcinoma ductal pancreático (ADP), por ser considerado um câncer de difícil tratamento, com sobrevida em 5 anos de 11%3.
O diagnóstico tardio, a rápida progressão e a falta de terapias eficazes continuam sendo os problemas clínicos mais prementes da ADP. O principal desafio é, portanto, modelar o paciente e identificar biomarcadores que possam ser aplicados na clínica para selecionar a terapia mais eficaz de acordo com a medicina personalizada 4,5,6. Ao longo do tempo, novas abordagens têm sido propostas para modelar doenças oncológicas: organoides derivados do paciente (PDOs) e xenoenxertos derivados do paciente de camundongo (mPDXs) originados de uma fonte de tecido tumoral humano. Eles têm sido usados para reproduzir a doença para estudar a resposta e a resistência à terapia, bem como a recorrência da doença 7,8,9.
Da mesma forma, o interesse em modelos de xenoenxerto derivado do paciente (zPDX) baseado em peixe-zebra tem aumentado, graças às suas características únicas epromissoras10, representando uma ferramenta rápida e de baixo custo para a pesquisa docâncer11,12. Os modelos zPDX requerem apenas um pequeno tamanho de amostra tumoral, o que torna viável o rastreamento de quimioterapiaem alto rendimento13. A técnica mais comumente utilizada para modelos zPDX baseia-se na digestão completa da amostra e implantação das populações celulares primárias, que reproduz parcialmente o tumor, mas tem como desvantagens a falta de microambiente tumoral e crosstalk entre células malignas esaudáveis14.
Este trabalho mostra como zPDXs podem ser usados como um modelo pré-clínico para identificar o perfil de quimiossensibilidade de pacientes com câncer de pâncreas. A valiosa estratégia facilita o processo de xenoenxerto, uma vez que não há necessidade de expansão celular, permitindo a aceleração da triagem quimioterápica. A força do modelo é que todos os componentes do microambiente são mantidos como estão no tecido do paciente com câncer, pois, como se sabe, o comportamento do tumor depende de sua interação15,16. Isso é altamente favorável em relação aos métodos alternativos na literatura, pois é possível preservar a heterogeneidade tumoral e contribuir para melhorar a previsibilidade do resultado do tratamento e a recidiva de forma paciente-específica, permitindo que o modelo zPDX seja utilizado em ensaios coclínicos. Este artigo descreve as etapas envolvidas na confecção do modelo zPDX, começando com um pedaço de ressecção tumoral do paciente e tratando-o para analisar a resposta à quimioterapia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Modelos in vivo na pesquisa do câncer fornecem ferramentas inestimáveis para entender a biologia do câncer e prever a resposta ao tratamento do câncer. Atualmente, diferentes modelos in vivo estão disponíveis, por exemplo, animais geneticamente modificados (camundongos transgênicos e knockout) ou xenoenxertos derivados de pacientes a partir de células primárias humanas. Apesar de muitas características ideais, cada um tem várias limitações. Em particular, os modelos acima mencionados carece…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fondazione Pisa (projeto 114/16). Os autores agradecem a Raffaele Gaeta, da Unidade de Histopatologia da Azienda Ospedaliera Pisana, pela seleção da amostra e apoio anatomopatológico. Agradecemos também a Alessia Galante pelo suporte técnico nos experimentos. Este artigo baseia-se no trabalho da COST Action TRANSPAN, CA21116, apoiado pela COST (Cooperação Europeia em Ciência e Tecnologia).
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
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