Etablering av sebrafisk pasientderiverte xenotransplantater fra bukspyttkjertelkreft for kjemosensitivitetstesting
Summary
Prekliniske modeller tar sikte på å fremme kunnskapen om kreftbiologi og forutsi behandlingseffekt. Denne artikkelen beskriver genereringen av sebrafiskbaserte pasientderiverte xenotransplantater (zPDX) med tumorvevsfragmenter. ZPDX-ene ble behandlet med kjemoterapi, hvis terapeutiske effekt ble vurdert med hensyn til celleapoptose i det transplanterte vevet.
Abstract
Kreft er en av de viktigste dødsårsakene over hele verden, og forekomsten av mange typer kreft fortsetter å øke. Mye fremgang har blitt gjort når det gjelder screening, forebygging og behandling; Imidlertid mangler fortsatt prekliniske modeller som forutsier kjemosensitivitetsprofilen til kreftpasienter. For å fylle dette gapet ble en in vivo pasientderivert xenograftmodell utviklet og validert. Modellen var basert på sebrafisk (Danio rerio) embryoer 2 dager etter befruktning, som ble brukt som mottakere av xenograftfragmenter av tumorvev tatt fra pasientens kirurgiske prøve.
Det er også verdt å merke seg at bioptiske prøver ikke ble fordøyd eller disaggregert for å opprettholde tumormikromiljøet, noe som er avgjørende når det gjelder å analysere tumoradferd og respons på terapi. Protokollen beskriver en metode for å etablere sebrafiskbaserte pasientderiverte xenotransplantater (zPDX) fra primær solid tumor kirurgisk reseksjon. Etter screening av en anatomopatolog, blir prøven dissekert ved hjelp av et skalpellblad. Nekrotisk vev, kar eller fettvev fjernes og hakkes deretter i 0,3 mm x 0,3 mm x 0,3 mm stykker.
Bitene blir deretter fluorescerende merket og xenotransplantert inn i perivitellinerommet til sebrafiskembryoer. Et stort antall embryoer kan behandles til en lav kostnad, noe som muliggjør høy gjennomstrømning in vivo-analyser av kjemosensitiviteten til zPDX for flere kreftmedisiner. Konfokale bilder blir rutinemessig anskaffet for å oppdage og kvantifisere de apoptotiske nivåene indusert av kjemoterapibehandling sammenlignet med kontrollgruppen. Xenograft-prosedyren har en betydelig tidsfordel, siden den kan fullføres på en enkelt dag, noe som gir et rimelig tidsvindu for å utføre en terapeutisk screening for samtidige kliniske studier.
Introduction
Et av problemene med klinisk kreftforskning er at kreft ikke er en enkelt sykdom, men en rekke forskjellige sykdommer som kan utvikle seg over tid, og krever spesifikke behandlinger avhengig av egenskapene til selve svulsten og pasienten1. Følgelig er utfordringen å bevege seg mot pasientorientert kreftforskning, for å identifisere nye personlige strategier for tidlig prediksjon av kreftbehandlingsresultater2. Dette er spesielt relevant for bukspyttkjertelduktalt adenokarsinom (PDAC), siden det regnes som en vanskelig å behandle kreft, med en 5-års overlevelsesrate på 11%3.
Den sene diagnosen, rask progresjon og mangel på effektive terapier forblir de mest presserende kliniske problemene med PDAC. Hovedutfordringen er derfor å modellere pasienten og identifisere biomarkører som kan brukes i klinikken for å velge den mest effektive terapien i tråd med persontilpasset medisin 4,5,6. Over tid har nye tilnærminger blitt foreslått for å modellere kreftsykdommer: pasientavledede organoider (PDOer) og muspatientavledede xenotransplantater (mPDX) stammer fra en kilde til humant tumorvev. De har blitt brukt til å reprodusere sykdommen for å studere responsen og motstanden mot terapi, samt sykdomsfall 7,8,9.
På samme måte har interessen for sebrafiskbaserte pasientavledede xenograftmodeller (zPDX) økt, takket være deres unike og lovende egenskaper10, som representerer et raskt og billig verktøy for kreftforskning11,12. zPDX-modeller krever bare en liten tumorprøvestørrelse, noe som gjør høy gjennomstrømningsscreening av kjemoterapi mulig13. Den vanligste teknikken som brukes til zPDX-modeller er basert på fullstendig prøvefordøyelse og implantasjon av de primære cellepopulasjonene, som delvis reproduserer svulsten, men har ulempene med mangel på tumormikromiljø og crosstalk mellom ondartede og friske celler14.
Dette arbeidet viser hvordan zPDX kan brukes som en preklinisk modell for å identifisere kjemosensitivitetsprofilen til pasienter med kreft i bukspyttkjertelen. Den verdifulle strategien letter xenograftprosessen, siden det ikke er behov for celleutvidelse, noe som muliggjør akselerasjon av kjemoterapiscreeningen. Modellens styrke er at alle mikromiljøkomponentene opprettholdes som de er i pasientens kreftvev, fordi, som det er kjent, avhenger svulstens oppførsel av samspillet15,16. Dette er svært gunstig i forhold til alternative metoder i litteraturen, da det er mulig å bevare tumorheterogeniteten og bidra til å forbedre forutsigbarheten av behandlingsutfall og tilbakefall på en pasientspesifikk måte, slik at zPDX-modellen kan brukes i kokliniske studier. Dette manuskriptet beskriver trinnene som er involvert i å lage zPDX-modellen, som starter med et stykke pasienttumorreseksjon og behandler det for å analysere responsen på kjemoterapi.
Protocol
Representative Results
Discussion
In vivo-modeller innen kreftforskning gir uvurderlige verktøy for å forstå kreftbiologi og forutsi kreftbehandlingsresponsen. For tiden er forskjellige in vivo-modeller tilgjengelige, for eksempel genetisk modifiserte dyr (transgene og knockoutmus) eller pasientavledede xenotransplantater fra humane primære celler. Til tross for mange optimale funksjoner, har hver og en forskjellige begrensninger. Spesielt mangler de nevnte modellene en pålitelig måte å etterligne pasientens tumorvevsmikromiljø …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av Fondazione Pisa (prosjekt 114/16). Forfatterne vil gjerne takke Raffaele Gaeta fra Histopathology Unit of Azienda Ospedaliera Pisana for pasientprøvevalg og patologistøtte. Vi takker også Alessia Galante for den tekniske støtten i eksperimentene. Denne artikkelen er basert på arbeid fra COST Action TRANSPAN, CA21116, støttet av COST (European Cooperation in Science and Technology).
Materials
| 5-fluorouracil | Teva Pharma AG | SMP 1532755 | |
| 48 multiwell plate | Sarstedt | 83 3923 | |
| 96 multiwell plate | Sarstedt | 82.1581.001 | |
| Acetone | Merck | 179124 | |
| Agarose powder | Merck | A9539 | |
| Amphotericin | Thermo Fisher Scientific | 15290018 | |
| Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Merck | MAB1281 | 1:200 dilution |
| Aquarium net QN6 | Penn-plax | 0-30172-23006-6 | |
| BSA | Merck | A9418 | |
| CellTrace | Thermo Fisher Scientific | C34567 | |
| CellTracker CM-DiI | Thermo Fisher Scientific | C7001 | |
| CellTracker Deep Red | Thermo Fisher Scientific | C34565 | |
| Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | 9661S | 1:250 dilution |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | PanReac AppliChem ITW Reagents | A3672,0250 | |
| Dumont #5 forceps | World Precision Instruments | 501985 | |
| Folinic acid - Lederfolin | Pfizer | ||
| Glass capillaries, 3.5" | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. |
| Glass vials | VWR International | WHEAW224581 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A-21244 | 1:500 dilution |
| Goat serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| Irinotecan | Hospira | ||
| Low Temperature Freezer Vials | VWR International | 479-1220 | |
| McIlwain Tissue Chopper | World Precision Instruments | ||
| Microplate Mixer | SCILOGEX | 822000049999 | |
| Oxaliplatin | Teva | ||
| Paraformaldehyde | Merck | P6148-500G | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190094 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Petri dish 100 mm | Sarstedt | 83 3902500 | |
| Petri dish 60 mm | Sarstedt | 83 3901 | |
| Plastic Pasteur pipette | Sarstedt | 86.1171.010 | |
| Poly-Mount | Tebu-bio | 18606-5 | |
| Propidium iodide | Merck | P4170 | |
| RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 11875093 | |
| Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel | VWR International | SWAN3001 | |
| Scalpel handle #3 | World Precision Instruments | 500236 | |
| Tricaine | Merck | E10521 | |
| Triton X-100 | Merck | T8787 | |
| Tween 20 | Merck | P9416 | |
| Vertical Micropipette Puller | Shutter instrument | P-30 |
Riferimenti
- Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
- Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
- Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
- Moffat, G. T., Epstein, A. S., O’Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
- Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
- Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
- Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
- Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
- Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
- Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
- Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
- Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
- Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
- Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
- Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
- Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
- Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).
