यहां, हम प्राथमिक रोगी नमूनों या रोगी-व्युत्पन्न सेल संस्कृतियों से ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने और उन्हें परिपक्वता तक बनाए रखने की एक विधि का वर्णन करते हैं। इन जीबीएम ऑर्गेनोइड्स में फेनोटाइपिक रूप से विविध सेल आबादी होती है और ट्यूमर माइक्रोएनवायरनमेंट पूर्व विवो को फिर से बनाते हैं।
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) एक बेहद खराब रोग का निदान के साथ सबसे अधिक होने वाला प्राथमिक घातक मस्तिष्क कैंसर है। इंट्रा-ट्यूमोरल सेलुलर और आणविक विविधता, साथ ही ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के बीच जटिल बातचीत, प्रभावी उपचार खोजने को एक चुनौती बना सकती है। पारंपरिक अनुयायी या क्षेत्र संस्कृति विधियां ऐसी जटिलताओं को मुखौटा कर सकती हैं, जबकि त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृति क्षेत्रीय माइक्रोएनवायरनमेंटल ग्रेडिएंट को पुन: प्राप्त कर सकती है। ऑर्गेनोइड्स त्रि-आयामी जीबीएम संस्कृति की एक विधि है जो रोगी ट्यूमर वास्तुकला की बेहतर नकल करती है, इसमें फेनोटाइपिक रूप से विविध सेल आबादी होती है, और इसका उपयोग मध्यम-थ्रूपुट प्रयोगों के लिए किया जा सकता है। यद्यपि त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृति पारंपरिक संस्कृति की तुलना में अधिक श्रमसाध्य और समय लेने वाली है, यह अद्वितीय लाभ प्रदान करती है और वर्तमान इन विट्रो और विवो सिस्टम के बीच की खाई को पाटने का काम कर सकती है। ऑर्गेनोइड्स ने ट्यूमर व्यवहार और प्रतिरोध के तंत्र को बेहतर ढंग से समझने के लिए कैंसर जीवविज्ञानियों के शस्त्रागार में खुद को अमूल्य उपकरण के रूप में स्थापित किया है, और उनके अनुप्रयोग केवल बढ़ते रहते हैं। यहां, जीबीएम ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने और बनाए रखने के तरीकों के बारे में विवरण प्रदान किया गया है। जमे हुए और पैराफिन-एम्बेडिंग तकनीकों दोनों का उपयोग करके ऑर्गेनोइड नमूना एम्बेडिंग और सेक्शनिंग करने के निर्देश, साथ ही ऑर्गेनोइड वर्गों पर इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के लिए सिफारिशें, और कुल ऑर्गेनोइड सेल व्यवहार्यता का माप, सभी का भी वर्णन किया गया है।
ग्लियोब्लास्टोमा (जीबीएम) निदान से लगभग 15 महीने के गंभीर पूर्वानुमान के साथ सबसे अधिक होने वाला प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमरहै। उपचार जो प्रीक्लिनिकल अध्ययनों में प्रभावी होते हैं, वे अक्सर रोगियों 2,3 में खराब प्रभावी हो सकते हैं। खराब नैदानिक प्रतिक्रिया को कई कारकों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है, जिसमें जीबीएम की सूक्ष्म पर्यावरणीय विषमता और जटिल इंट्रा-ट्यूमरल इंटरैक्शन शामिल हैं। पारंपरिक अनुयायी या क्षेत्र संस्कृति विधियों के साथ प्रयोगशाला सेटिंग में इन्हें फिर से बनाना मुश्किल हो सकताहै 4. जीबीएम के भीतर स्व-नवीनीकरण कैंसर स्टेम कोशिकाओं (सीएससी) के सबसेट की उपस्थिति भी इस जटिलता 5,6 में योगदान दे सकती है। सीएससी ट्यूमर प्रसार के लिए महत्वपूर्ण हैं और सक्रिय एंजियोजेनेसिस, कैंसर आक्रमण और विकिरण 7,8,9 सहितउपचारों के प्रतिरोध को बढ़ावा देकर ट्यूमर के विकास को बनाए रखते हैं। सीएससी ट्यूमर में समान रूप से वितरित नहीं किए जाते हैं, बल्कि विशिष्ट सूक्ष्म वातावरण के भीतर समृद्ध होते हैं, जिसमें पेरिवास्कुलर आला और पेरिनेक्रोटिक क्षेत्र शामिल हैं, जो प्रत्येक अपने सेलुलर राज्यों 10,11,12,13,14 के अलग-अलग आणविक विनियमन प्रदान करते हैं। सीएससी माइक्रोएनवायरनमेंटल संकेतों के निष्क्रिय प्राप्तकर्ता नहीं हैं, बल्कि इसके बजाय अपने स्वयं के माइक्रोएन्वायरमेंट 7,15,16 को फिर से तैयार करने की क्षमता रखते हैं। सीएससी का सूक्ष्म वातावरण पोषक तत्वों की कमी, पीएच और हाइपोक्सिया17,18,19,20 जैसे दबावों के जवाब में स्टेम सेल राज्य के रखरखाव को बढ़ावा दे सकता है, जो एक मॉडल प्रणाली में इन स्थितियों के महत्व का सुझाव देता है। ट्यूमर के भीतर विविध सेलुलर माइक्रोएन्वायरमेंट का पुनरावृत्ति इसलिए चिकित्सीय प्रतिरोध को समझने और उपन्यास उपचारों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है।
त्रि-आयामी संस्कृति हाल के वर्षों में लोकप्रियता में वृद्धि हुई है21,22. ऑर्गेनोइड का उपयोग अन्य प्रकार के कैंसर में किया गया है, और ऑर्गेनोइड के रूप में कोशिकाओं को बनाए रखने का प्राथमिक लक्ष्य विषम कोशिका आबादी (जिनमें से कई सामान्य रूप से अधिक सजातीय क्षेत्र संस्कृति में आगे निकल सकते हैं) और स्थानिक विविधता के विकास की अनुमति देना है, जिसे आनुवंशिक विशिष्टता 4,23,24,25,26 के साथ क्षेत्रीय ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के रूप में देखा जाता है . कैंसर कोशिकाओं की त्रि-आयामी संस्कृति के लिए कई तरीके हैं, जिनमें से प्रत्येक के फायदे और नुकसान 27,28,29 हैं। ऑर्गेनोइड संस्कृति पारंपरिक अनुयायी या क्षेत्र संस्कृति के प्रतिस्थापन का इरादा नहीं है। यह दो आयामी तरीकों के पूरक तकनीक के रूप में सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है जब विशिष्ट प्रश्न होते हैं जहां सेल माइक्रोएन्वायरमेंट और ट्यूमर सेल प्रतिक्रियाओं के बीच बातचीत महत्वपूर्ण होती है।
यह आलेख प्राथमिक रोगी नमूनों या रोगी-व्युत्पन्न संस्कृतियों से जीबीएम ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए विश्वसनीय और दोहराने योग्य तरीकों का वर्णन करता है। हम त्रि-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए दो अलग-अलग उद्देश्यों को संबोधित करते हैं: (1) प्राथमिक रोगी ऊतक से ऑर्गेनोइड की स्थापना, एकरूपता की परवाह किए बिना अधिकतम एनग्राफ्टमेंट क्षमता के साथ, या (2) अधिक मात्रात्मक प्रयोगात्मक उपयोग के लिए समान ऑर्गेनोइड बढ़ रहा है। ऑर्गेनोइड के रूप में एक प्राथमिक नमूने की स्थापना करते समय, एकल कोशिकाओं या गिनती कोशिकाओं के लिए फ़िल्टर करना आवश्यक नहीं है, क्योंकि प्रारंभिक संस्कृति स्थापित करने के लिए अधिकतम सेल नंबर और प्रकार रखना प्राथमिकता है। तुलनात्मक प्रयोगों के लिए ऑर्गेनोइड बढ़ते समय, हालांकि, एकल-कोशिका निस्पंदन और सेल गिनती की आवश्यकता होती है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि प्रतिकृति ऑर्गेनोइड प्रयोगात्मक स्थिरता के लिए तुलनीय हैं। यह प्रोटोकॉल ऑर्गेनोइड संस्कृतियों को स्थापित करने और समान ऑर्गेनोइड बनाने के साथ-साथ ऑर्गेनोइड और मानक सेल संस्कृति प्रयोगों को एम्बेड करने और संरक्षित करने के लिए परिष्कृत तरीकों का विवरण देता है, जिसमें इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री, इम्यूनोफ्लोरेसेंस और जीबीएम ऑर्गेनोइड में कुल सेल व्यवहार्यता का आकलन शामिल है।
जीबीएम ऑर्गेनोइड पारंपरिक क्षेत्रों के लिए एक पूरक संस्कृति विधि है जिसमें अधिक सेलुलर और माइक्रोएनवायरनमेंटल विषमता 4,22,30 शामिल है। हालांकि अधिक समय और संसाधन-गहन, ऑर्गेनोइड संस्कृति इंट्रा-ट्यूमरल व्यवहार और दवा प्रतिरोध के तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती है।
जीबीएम सीएससी 5,31 की आबादी से प्रेरित है, और इन तरीकों को इस सीएससी आबादी के निरंतर विकास और आत्म-नवीकरण की अनुमति देने के लिए विकसित किया गया था। एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (ईजीएफ) और फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (एफजीएफ) स्टेम सेल रखरखाव और विकास को बढ़ाने और सक्रिय रिसेप्टर टायरोसिन किनेज (आरटीके) सिग्नलिंग प्रदान करने के लिए जाने जाते हैं। जीबीएम ट्यूमर के भीतर विषम सेलुलर आबादी और अलग-अलग ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का गठन सीएससी व्यवहार का समर्थन करने पर निर्भर करता है। एक एलआरईसीएम का चयन लैमिनिन समृद्ध मस्तिष्क वातावरण की नकल करता है और आक्रमण द्वारा आत्म-संगठित और पलायन करने के लिए ऑर्गेनोइड संस्कृति में कोशिकाओं का समर्थन करता है। हालांकि कुछ समूहों ने एलआरईसीएम या ईजीएफ / एफजीएफ समृद्ध मीडिया24,28 के उपयोग के बिना ऑर्गेनोइड संस्कृति की स्थापना की है, जो इस संस्कृति विधि के अधिक समय-कुशल तरीके और विकास को चलाने के लिए ऑन्कोजेनिक सिग्नलिंग के मजबूत चयन की पेशकश कर सकता है, इन तरीकों को ऑर्गेनोइड की सेलुलर विषमता को सर्वोत्तम रूप से स्थापित करने के लिए प्रो-स्टेम सेल पर्यावरण को अनुकूलित करने के लिए चुना गया था। सेरेब्रल ऑर्गेनोइड और जीबीएम ऑर्गेनोइड दोनों को साहित्य में एलआरईसीएम के साथ पहले21,32,33 बनाया गया है। यद्यपि हमने ऑर्गेनोइड और स्थानिक भिन्नता के भीतर पाए जाने वाले ट्यूमर आबादी के बारे में डेटा स्थापित किया है, ऑर्गेनोइड के भीतर गैर-ट्यूमर आबादी के बारे में कम जाना जाता है और वे मूल रोगी नमूनों से कितने समय तक जीवित रहते हैं। कुछ आईएचसी दाग (जैसे सीडी 45) इस डेटा को प्रदान कर सकते हैं, और ऑर्गेनोइड के साथ भविष्य में अनुसंधान का एक दिलचस्प बिंदु हो सकता है।
ऑर्गेनोइड संस्कृति के लिए इच्छित उपयोग को जानना उचित तरीकों का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। विशिष्ट प्रयोगों के लिए बढ़ते समान ऑर्गेनोइड बनाम प्राथमिक नमूनों से ऑर्गेनोइड की स्थापना में थोड़ी अलग प्रक्रियाएं हैं। ऑर्गेनोइड संस्कृति की दिशा में उचित समय और संसाधनों को आवंटित करने में सक्षम होने के लिए एलआरईसीएम मचान में ऑर्गेनोइड कैसे परिपक्व और नेत्रहीन रूप से भरते हैं, इसके लिए प्रशंसा करना महत्वपूर्ण है। ऑर्गेनोइड में कोशिकाओं के विरल क्षेत्र धीरे-धीरे विस्तार करेंगे और एलआरईसीएम को भरने के लिए बढ़ेंगे, जो नमूने के व्यवहार के आधार पर 2-8 सप्ताह से कहीं भी ले सकते हैं। विकास की यह दर प्रत्येक नमूने के लिए कुछ हद तक आंतरिक है; यह ऑर्गेनोइड के विभिन्न बैचों में संरक्षित है और क्षेत्र के विकास की सापेक्ष दर के साथ काफी सुसंगत है। ऑर्गेनोइड को 1 वर्ष से अधिक समय तक बनाए रखा जा सकता है और चूहों में ज़ेनोग्राफ्ट पर ट्यूमर गठन क्षमताओं को बनाए रखा जा सकता है; हालाँकि, उन्हें एक अलग उद्देश्य के साथ विकसित करने की सिफारिश की जाती है क्योंकि प्रयोगशाला संसाधनों (सामग्री और समय दोनों) को बर्बाद नहीं किया जाता है। ऑर्गेनोइड वृद्धि को कई अच्छी तरह से आकारों और प्रारूपों में परीक्षण किया गया है, और यह दर्शाता है कि 10 सेमी प्लेट इष्टतम सेल व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए आदर्श सेटिंग है, इसके बाद प्रति अच्छी तरह से34 में तीन ऑर्गेनोइड के साथ 6-अच्छी प्लेट है। ऑर्गेनोइड अपने दो-आयामी संस्कृति समकक्षों की तुलना में अधिक मीडिया का उपभोग करते हैं, और एक छोटे अच्छी तरह से प्रारूप का उपयोग करने से उचित रखरखाव नहीं होता है। उदाहरण के लिए, 96-अच्छी तरह से प्रारूप प्लेट के एक कुएं में ऑर्गेनोइड विकास को बनाए रखने के लिए ऑर्गेनोइड के आकार के सापेक्ष पर्याप्त स्थान या मीडिया वॉल्यूम नहीं होता है।
जैसा कि ऑर्गेनोइड स्थापित करते हैं, सफलता बढ़ाने के लिए चौकस होना महत्वपूर्ण है। प्रारंभ में, ऑर्गेनोइड धीरे-धीरे मीडिया का उपभोग करेंगे, लेकिन जैसे-जैसे वे सघन और अधिक परिपक्व होते जाएंगे, वे मीडिया का अधिक तेज़ी से उपभोग करेंगे। मीडिया में फिनोल लाल जोड़ने से मीडिया खपत के संकेतक के रूप में काम करने में मदद मिल सकती है। जब मीडिया अधिक पीला होता है, तो यह हमें खिला पैटर्न को समायोजित करने के लिए प्रेरित कर सकता है, चाहे वह मीडिया की उच्च मात्रा का आदान-प्रदान करना हो, प्लेट में कुल मीडिया राशि में वृद्धि हो, ऑर्गेनोइड को उनके विकास को बनाए रखने के लिए कई सेल संस्कृति प्लेटों के बीच विभाजित करें, या यहां तक कि प्रयोगों के लिए समयरेखा को समायोजित करें।
कई मायनों में, ऑर्गेनोइड कैंसर अनुसंधान करने का एक अक्षम तरीका है। वे लंबे समय के तराजू को शामिल करते हैं, और जीबीएम क्षेत्र संस्कृति की तुलना में महंगे और संसाधन-भारी हैं। हालांकि, रोगी-व्युत्पन्न ज़ेनोग्राफ्ट की तुलना में, सेलुलर और माइक्रोएन्वायरमेंटल विविधता को फिर से बनाने के लिए एक वैकल्पिक विधि, वे अधिक सरल, कम महंगे और नियंत्रणीय हैं। ऑर्गेनोइड का सबसे अच्छा उपयोग कब करना है, इसका चयन कैंसर शोधकर्ताओं के लिए महत्वपूर्ण है। वे पारंपरिक क्षेत्र या अनुयायी संस्कृति को बदलने का इरादा नहीं रखते हैं और ज़ेनोग्राफ्ट मॉडल को प्रतिस्थापित करने के लिए नहीं हैं। ऑर्गेनोइड, जब सही वैज्ञानिक प्रश्न पर लागू होते हैं, तो इन दोनों प्रणालियों के लाभों को जोड़ सकते हैं और हमें ट्यूमर कोशिका जीव विज्ञान का निरीक्षण करने की अनुमति दे सकते हैं जो अन्यथा छिपे रहेंगे। वैज्ञानिक समुदाय केवल यह समझना शुरू कर रहा है कि ऑर्गेनोइड क्या सीखने के अवसर प्रदान करते हैं, लेकिन यह स्पष्ट है कि वे जीबीएम के जटिल जीव विज्ञान को समझने के लिए भविष्य में एक अमूल्य उपकरण होंगे।
The authors have nothing to disclose.
हम डॉ जस्टिन लाठिया को उनकी अमूल्य सलाह और चल रहे समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। हम कैटरीना मुरली, लिसा वालेस और माया कैम्ही को उनके उत्कृष्ट तकनीकी समर्थन के लिए भी धन्यवाद देते हैं।
3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets | MP Biomedicals | 08980681 | 3,3-Diaminobenzidine (DAB) tablets |
96-well PCR plates | ThermoFisher Scientific | 96-well PCR plates | |
Accutase | ThermoFisher Scientific | SCR005 | Cell detachment solution |
Antibiotic-antimycotic | ThermoFisher Scientific | 15240062 | Antibiotic-antimycotic |
B-27 supplement minus vitamin A | ThermoFisher Scientific | 12587001 | B-27 supplement minus vitamin A (50x) |
GelCode Blue Stain Reagent | ThermoFisher Scientific | 24590 | Bluing reagent |
Cell strainer (70 µm) | CellTreat Scientific | 229483 | Cell strainer (70 µm) |
CellTiter-Glo 3D | Promega | G9681 | Luminescent cell viability assay |
Clarifier 2 | ThermoFisher Scientific | 7301 | Nuclear hematoxylin clarifying reagent |
Clear-Rite 3 | ThermoFisher Scientific | 6901 | xylene substitute |
Epredia Gill 2 Hematoxylin | ThermoFisher Scientific | 72504 | Hematoxylin |
Glutamine in 0.85% NaCl | ThermoFisher Scientific | 35050061 | Glutamine in 0.85% NaCl (200 mM) |
Matrigel | ThermoFisher Scientific | 354234 | Laminin-enriched extracellular matrix |
Mini PAP pen | ThermoFisher Scientific | 008877 | Hydrophobic barrier pen |
Mounting medium | ThermoFisher Scientific | 22-050-102 | Mounting medium |
Neurobasal media minus phenol red | ThermoFisher Scientific | 12349015 | Neurobasal media minus phenol red (500 mL) |
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Paraformaldehyde 4% in PBS | ThermoFisher Scientific | AAJ19943K2 | Paraformaldehyde 4% in PBS |
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