히알루론산 35kDa가 장내 유래 단분자층을 사용한 조기 소장 손상 및 치유의 시험관 내 모델에 미치는 영향
Summary
이 프로토콜은 인간이 아닌 영장류 회장으로부터 분리된 3차원(3D) 엔테로이드로부터 유래된 2차원(2D) 단층에 대한 스크래치 상처 분석을 확립하고 수행하는 방법을 설명한다.
Abstract
시험관 내 스크래치 상처 분석은 일반적으로 다양한 조직 유형에서 상피 치유의 메커니즘과 특성을 조사하는 데 사용됩니다. 여기에서는 회장의 장 음와에서 유래한 3차원(3D) 비인간 영장류 엔테로이드로부터 2차원(2D) 단층을 생성하는 프로토콜을 설명합니다. 그런 다음 이러한 장내 유래 단분자층을 시험 관 내 스크래치 상처 분석에 활용하여 모유 HA 모방체인 히알루로난 35kDa(HA35)가 상피 상처 가장자리를 따라 세포 이동 및 증식을 촉진하는 능력을 테스트했습니다. 단층이 컨플루언스로 성장한 후 수동으로 긁어 HA35(50μg/mL, 100μg/mL, 200μg/mL) 또는 대조군(PBS)으로 처리했습니다. 간극으로의 세포 이동 및 증식은 살아있는 세포 이미징을 위해 장착된 투과광 현미경을 사용하여 이미지화되었습니다. 상처 봉합은 ImageJ의 상처 치유 크기 플러그인을 사용하여 상처 치유 백분율로 정량화되었습니다. 스크래치 영역과 세포 이동 속도 및 상처 봉합 비율을 24시간에 걸쳐 측정했습니다. 시험 관 내 HA35는 상처 가장자리에서의 세포 증식과 상처 영역으로의 이동의 조합을 통해 소장 장내 단층에서 상처 치유를 가속화합니다. 이러한 방법은 잠재적으로 조산 인간 소장에서 장 재생을 탐구하는 모델로 사용될 수 있습니다.
Introduction
괴사성 장염(NEC)은 미숙아에서 가장 흔한 위장 응급 상황 중하나입니다1. 이 질병은 장 괴사, 패혈증 및 잠재적으로 사망으로 빠르게 악화 될 수있는 심각한 장 염증을 특징으로합니다. 병인은 불분명하지만 증거에 따르면 NEC는 다인성이며 섭식, 비정상적인 박테리아 집락화 및 미성숙 장 상피 2,3의 복잡한 상호 작용의 결과입니다. 미숙아는 장 투과성, 비정상적인 박테리아 집락화 및 낮은 장 세포 재생 능력4,5를 증가시켜 장 장벽 기능 장애, 박테리아 전좌 및 NEC 발달의 위험을 증가시킵니다. 따라서 장 상피 성숙을 가속화하고 장 상피의 재생 또는 치유를 촉진하는 전략이나 중재를 식별하는 것이 이 치명적인 질병을 예방하는 데 중요합니다.
연구에 따르면 모유(HM)는 조산아 6,7,8,9,10,11에서 NEC를 예방합니다. 인간과 동물 연구 모두 소 기반 분유가 장 투과성을 증가시키고 장 상피 세포에 직접 독성이 있음을 보여주었습니다 2,12. 완전히 밝혀지지는 않았지만, 증거는 HM의 보호 효과가 락토페린, 면역 글로불린 A (IgA) 및 HM 올리고당13과 같은 생리 활성 성분을 통해 매개된다는 것을 시사한다. HM은 또한 D- 글루 쿠 론산과 N- 아세틸 -D- 글루코사민 이당류14,15를 반복하는 독특한 비 황산화 글리코 사 미노 글리 칸 인 히알루 론산 (HA)이 풍부합니다. 중요하게도, 우리는 HM HA 모방체인 경구 35kDa HA(HA35)가 장 손상의 중증도를 약화시키고 박테리아 전좌를 방지하며 쥐 NEC 유사 장 손상 모델16,17에서 사망률을 감소시킨다는 것을 보여주었습니다.
여기에서, HA35가 장 치유 및 체외 재생에 미치는 영향을 추가로 조사한다. 현재, 장 상처 및 복구를 위해 가장 널리 사용되는 시험관 내 분석은 대장 암 (CRC) 세포 단층에서 수행되는 스크래치 상처 분석입니다. CRC 세포의 상처 복구가 줄기 세포 구동 복구 과정18보다는 암세포의 고도로 증식 된 특성에 크게 의존하기 때문에 조산아 장에 대한 이러한 모델의 생리 학적 관련성은 제한적입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 조산아 비인간 영장류(NHP)로부터 1차 줄기세포 유래 소장 장내로이드를 분리 및 유지하는 절차를 포함하는 2D 장내 스크래치 상처 모델의 확립이 여기에 설명되어 있다. 조기 NEC가 원위 소장에서 가장 흔하게 보고된다는 점을 감안할 때, 장 손상 및 복구 모델에서 일차 상피 세포 오가노이드의 사용은 전통적인 결장직장 단일층을 활용하는 기존 모델과 비교하여 보다 생리학적으로 번역가능한 시험관 내 모델을 제공합니다18,19.
Protocol
이 연구의 모든 동물 절차는 오클라호마 대학 건강 과학 센터 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 기관 승인 후, 별도의 연구를 위해 안락사 후 조산한 비인간 영장류(NHP, 90% 임신, 올리브 개코원숭이, Papio anubis)의 태아 소장 편의 샘플을 얻었습니다(프로토콜 #101523-16-039-I)20. 1. 조산 비인간 영장류 3D 장내 장내 확립 <li…
Representative Results
다양한 조직과 기관의 조직 복구 및 상처 치유에 대한 HA의 효과는 잘 문서화되어 있습니다. 그러나 분자량이 35kDa 인 HA가 태아 또는 신생아 소장 치유 및 재생에 미치는 구체적인 효과는 현재 알려져 있지 않습니다. 태아 또는 신생아 소장 모델에서 상처 치유를 촉진하는 HA35의 능력을 테스트하기 위해 NHP 회장 조직에서 3D 장 장내 조직을 생성하고 이 조직을 단일 세포로 추가로 해리하여 2D 장내 ?…
Discussion
조산아의 위장관은 dysbiosis, 염증성 박테리아 대사 산물 및 독소, 간헐적 저산소증과 관련된 환경 모욕에 반복적으로 노출되어 지속적인 재생 압력을 받고 있습니다23,24. 불행히도, 미숙아의 장 상피는 기능적 완전성을 빠르게 확립 할 수 없습니다23, 장벽 기능 장애, 장 투과성 증가, 심한 경우 만연한 장 염증 및 NEC 발달을 초래합니다.<…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. HC는 국립 보건원의 보조금 P20GM134973의 지원을 받습니다. KB는 어린이 병원 재단 (CHF) 및 장로교 건강 재단 (PHF) 보조금의 지원을 받고 있습니다. Cancer Functional Genomics 코어에서 제공하는 라이브 셀 이미징 서비스는 오클라호마 대학 보건 과학 센터 스티븐슨 암 센터에 수여 된 국립 보건원의 국립 일반 의학 연구소 보조금 P20GM103639 및 국립 암 연구소 보조금 P30CA225520에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| 10 mL Serological Pipet | Fisher Scientific | 13-675-49 | |
| 100x21mm Dish, Nunclon Delta | ThermoFisher Scientific | 172931 | |
| 15 mL Conical tube | VWR | 89039-666 | |
| 24-Well, TC-Treated, Flat Bottom Plate | Corning | 3524 | |
| 37 µM Reversible Cell Strainer | STEMCELL Technologies | 27215 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 89039-658 | |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Fisher Scientific | FB22-363-548 | |
| Albumin, Bovine (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay | Promega | G9681 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Ham's Mixture F-12 (DMEM-F12) with 15 mM HEPES buffer | STEMCELL Technologies | 36254 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | STEMCELL Technologies | 100-0485 | |
| ImageJ | NIH | imagej.nih.gov/ij/ | |
| Incucyte S3 Live-Cell Analysis Instrument | Sartorius | 4647 | |
| Incucyte Scratch Wound Analysis Software Module | Sartorius | 9600-0012 | |
| IntestiCult Organoid Growth Medium (Human) | STEMCELL Technologies | 06010 | This is HOGMY, but without the Y-27632 or antibiotics. Also used as base for HOGM, but then only missing the antibiotics. |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4, purified by gel filtration chromatography | Millipore Sigma | L3012-10MG | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, Phenol Red-Free | Corning | 356231 | |
| Nunc MicroWell 96-Well, Nunclon Delta-Treated, Flat-Bottom Microplate | ThermoFisher Scientific | 136101 | |
| PBS (Phosphate-Buffered Saline), 1X [-] Calcium, Magnesium, pH 7.4 | Corning | 21-040-CM | |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | This is broad-spectrum antibiotics |
| Sodium Hyaluronate, Research Grade, HA20K | Lifecore Biomedical | HA20K-1 | |
| TC20 Automated Cell Counter | Company: Bio-Rad | 1450102 | |
| Trypsin-EDTA 1X, 0.25% Trypsin | Fisher Scientific | MT25053CI | |
| Y-27632 | STEMCELL Technologies | 72302 |
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Citazione di questo articolo
Wilson, A., Burge, K., Eckert, J., Chaaban, H. Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers. J. Vis. Exp. (185), e63758, doi:10.3791/63758 (2022).