Den nuværende protokol beskriver undersøgelsen af neutrofil-biofilminteraktioner. Staphylococcus aureus biofilm etableres in vitro og inkuberes med perifere blodafledte humane neutrofiler. Det oxidative burstrespons fra neutrofiler kvantificeres, og neutrofillokaliseringen i biofilmen bestemmes ved mikroskopi.
Neutrofiler er den første forsvarslinje, der anvendes af immunsystemet under mikrobiel infektion. In vivo rekrutteres neutrofiler til infektionsstedet, hvor de bruger processer som fagocytose, produktion af reaktivt ilt og nitrogenarter (henholdsvis ROS, RNS), NETosis (neutrofil ekstracellulær fælde) og degranulering for at dræbe mikrober og løse infektionen. Interaktioner mellem neutrofiler og planktoniske mikrober er blevet grundigt undersøgt. Der har været nye interesser i at studere infektioner forårsaget af biofilm i de senere år. Biofilm udviser egenskaber, herunder tolerance over for drab af neutrofiler, adskilt fra deres planktoniske dyrkede modstykker. Med den vellykkede etablering af både in vitro- og in vivo-biofilmmodeller kan interaktioner mellem disse mikrobielle samfund med forskellige immunceller nu undersøges. Her er teknikker, der bruger en kombination af traditionelle biofilmmodeller og veletablerede neutrofile aktivitetsassays, skræddersyet specifikt til at studere neutrofile og biofilminteraktioner. Bredfeltsfluorescensmikroskopi bruges til at overvåge lokaliseringen af neutrofiler i biofilm. Disse biofilm dyrkes under statiske forhold efterfulgt af tilsætning af neutrofiler afledt af humant perifert blod. Prøverne farves med passende farvestoffer inden visualisering under mikroskopet. Derudover kvantificeres produktionen af ROS, som er et af de mange neutrofile reaktioner mod patogener, i nærværelse af en biofilm. Tilføjelsen af immunceller til dette etablerede system vil udvide forståelsen af værtspatogeninteraktioner, samtidig med at brugen af standardiserede og optimerede betingelser sikres til at måle disse processer nøjagtigt.
En biofilm er et fællesskab af overfladeassocierede mikrober eller ikke-vedhæftede aggregater indkapslet i et ekstracellulært polymerstof (EPS)1,2. Disse samfund beskytter de indkapslede mikroorganismer mod miljømæssige stressfaktorer, herunder tolerance over for antimikrobielle midler og immunsystemet3. Flere patogene mikrobielle arter danner biofilm, der har været forbundet med kroniske infektioner4. Udviklingen af biofilm er en indviklet proces, der involverer fastgørelse til overflader, EPS-produktion, celleproliferation, biofilmstrukturering og celleløsrivelse5. Når celler spredes for at danne en biofilm, forbliver de planktoniske eller translokerer til et nyt underlag og genoptager biofilmudvikling6.
Staphylococcus aureus, et opportunistisk patogen, følger en generel ordning for biofilmudvikling, herunder vedhæftning, spredning, modning og spredning7. Fastgørelsesprocessen i S. aureus biofilm dikteres af hydrofobe interaktioner, teichoesyrer og mikrobielle overfladekomponenter, der genkender klæbende matrixmolekyler (MSCRAMMs)8,9. Når spredningen af S. aureus begynder, produceres EPS, som primært består af polysaccharider, proteiner, ekstracellulært DNA og teichoesyrer,5. Efterhånden som EPS-komponenter produceres, produceres også forskellige exoenzymer og små molekyler, hvilket bidrager til biofilmens 3-dimensionelle struktur og hjælper med løsrivelse5. S. aureus udnytter denne stærkt koordinerede livsstil til at etablere forskellige kroniske infektioner, herunder infektioner på grund af indboing af medicinsk udstyr10.
Methicillinresistent S. aureus (MRSA) er en af de førende årsager til infektioner relateret til indwelling medicinsk udstyr, såsom centrale vene- og urinkatetre, proteser, pacemakere, mekaniske hjerteklapper og intrauterin udstyr11. Under sådanne infektioner er neutrofiler de første værtsimmunceller, der rekrutteres til infektionsstedet for at bekæmpe patogener via flere strategier12. Disse omfatter fagocytose, degranulering, reaktiv ilt og nitrogenarter (ROS / RNS) produktion eller frigivelse af neutrofile ekstracellulære fælder (NET’er) for at eliminere patogener13.
Generering af ROS ved fagocytose af mikrober er et af de vigtigste antimikrobielle reaktioner udstillet af neutrofiler14. Fagocytose forstærkes, hvis mikrober er belagt med opsoniner, især immunoglobuliner og komplementkomponenter, der findes i serum15. De opsoniserede mikrober genkendes derefter af celleoverfladereceptorer på neutrofiler og opsluges og danner et rum kaldet fagosomet15. Neutrofiler genererer og frigiver ROS i fagosomet via den membranassocierede NADPH-oxidase16. Dette multikomponentenzymkompleks genererer superoxidanioner ved at overføre elektroner til molekylært ilt16. Derudover genererer neutrofiler også RNS gennem ekspression af inducerbar nitrogenoxidsyntase (iNOS)17. Disse høje superoxid- og nitrogenoxidradikaler i fagosomet har brede antimikrobielle aktiviteter. De kan interagere med metalcentre i enzymer og beskadige nukleinsyrer, proteiner og cellemembraner af patogenet 18,19,20,21. Talrige mikrober vedtager en biofilm-livsstil og anvender forskellige strategier for at undgå drab med ROS22,23. Således er standardiserede assays, der parrer biofilm med neutrofiler for at kvantificere ROS, gavnlige for ensartede resultater.
Mens assays, såsom kvantificering af neutrofil ROS-produktion, giver information om neutrofilers reaktioner på biofilm, kan evnen til at visualisere interaktionerne mellem neutrofiler i en biofilm også tjene som et kraftfuldt værktøj. Brugen af fluorescerende farvestoffer til mikroskopi kræver ofte optimering for at opnå billeder af høj kvalitet, der kan bruges til mikroskopibilledanalyse. Fleksibiliteten til at optimere nogle forhold er begrænset, da neutrofiler kan gennemgå celledød efter isolation. Desuden vaskes biofilm typisk for at fjerne planktonpopulationen fra den eksperimentelle opsætning før tilsætning af neutrofiler. Under vask kan der opstå variation mellem replikate biofilm på grund af tab af delvis biomasse, hvis biofilm klæbes løst til overfladen.
Generelt omfatter nuværende metoder på området til analyse af interaktioner mellem neutrofiler og biofilm hovedsageligt mikroskopi, flowcytometri og kolonidannende enheder (CFU) optælling24,25,26,27. Mikroskopi involverer brugen af farvestoffer, der enten direkte pletter neutrofiler og biofilm eller målretter forskellige neutrofile reaktioner mod mikrober såsom NET-dannelse, degranulering og celledød25,28. En delmængde af disse reaktioner, såsom neutrofil celledød og degranulering, kan også analyseres via flowcytometri, men kræver, at neutrofiler fortrinsvis ikke er forbundet med store aggregater af mikrober i en biofilm28,29. Flowcytometri kan også kvantificere nogle biofilmparametre, såsom cellelevedygtighed27. Disse processer kræver imidlertid forstyrrelse af biofilmbiomassen og ville ikke være nyttige til at visualisere andre vigtige interaktioner såsom den rumlige fordeling af neutrofiler og deres komponenter i en biofilm27,29,30.
Den nuværende protokol fokuserer på at tilpasse nogle af de traditionelt anvendte metoder til at studere neutrofil-biofilminteraktioner på biofilm, der er optimeret til at give minimal variation under håndtering. Denne protokol giver således standardiserede metoder til at dyrke og kvantificere biofilm, isolere primære humane neutrofiler fra perifert blod, kvantificere ROS-produktion og visualisere biofilm-neutrofile interaktioner via mikroskopi. Denne protokol kan tilpasses forskellige systemer til at forstå biofilm-neutrofile interaktioner, samtidig med at heterogeniteten blandt donorpuljer overvejes.
Der har været adskillige bestræbelser på at vokse robuste og reproducerbare S. aureus biofilm til downstream eksperimenter in vitro48,49,50. En standardiseret protokol er skitseret, der udnytter PLL’s kationiske karakter samt supplerer medierne med glukose til vækst af robuste in vitro S. aureus biofilm. Tilsætningen af PLL giver mulighed for bedre fastgørelse af den negativt ladede bakteriecelle til de positivt ladede PLL-belagte overflader. Det er vigtigt at bemærke, at PLL ved en koncentration på 10 μg/ml har antimikrobiel aktivitet mod Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli og S. aureus, når den inkuberes i 24 timer51. Den samme koncentration bruges til at belægge overflader; overskydende PLL aspireres dog, hvilket gør koncentrationen af PLL lavere end 10 μg/ml ved såning til biofilmvækst.
Det er vigtigt at bemærke, at PLL kun har fungeret i specifikke vækstmedier som MEMα med 2% glucose, hvor det blev observeret, at S. aureus producerede robuste biofilm med minimal variabilitet (figur 2A). PLL-koncentration, der skal bruges sammen med andre medietyper, ville kræve yderligere optimering, såsom at bruge en øget koncentration af PLL til at belægge brøndene. Derudover er disse forhold blevet optimeret til en monospecies S. aureus biofilm. Mens kroniske sårbiofilm ofte er polymikrobielle, er standardisering af assays til undersøgelse af monospecies biofilm og dens interaktioner med neutrofiler og andre immunceller nøglen til at forstå deres bidrag til patogenese52. Disse standardiserede protokoller kan optimeres yderligere for at opretholde og studere polymikrobielle biofilm og deres interaktioner med neutrofiler.
Det blev også observeret, at rige bakteriekulturmedier, såsom TSB, førte til tab af neutrofil levedygtighed (figur 1). Derfor blev vækstbetingelserne for S. aureus biofilm i MEMα, der anvendes til pattedyrcellekulturer, optimeret. For undersøgelser, der involverer neutrofiler, understøtter dette medie neutrofil levedygtighed og fremmer S. aureus vækst. Mens det blev observeret, at medier påvirker levedygtigheden af neutrofiler, er det også vigtigt at overveje, at neutrofiler isoleret fra perifert humant blod gennemgår apoptose ex vivo med ca. 70% apoptotiske neutrofiler ved 20 h53. Dette kræver korrekt håndtering, såsom opbevaring af neutrofilerne på is, når man forbereder sig til forsøg, ved hjælp af endotoksinfrie reagenser og forhindrer aktivering af neutrofiler ved at undgå hvirvel af prøver med neutrofiler.
Vurderingen af oxidativ burst i neutrofiler udføres rutinemæssigt for at bestemme den dræbende virkning af neutrofiler på patogenet14,54,55. Disse undersøgelser udføres ofte med planktoniske bakterier, hvor neutrofiler tilsættes, og det oxidative burstrespons kvantificeres ved hjælp af luminolforstærket kemiluminescens, der detekterer superoxidanioner produceret af neutrofiler. Den nuværende protokol ændres ved at erstatte planktoniske bakterier med statisk dyrket 18 h S. aureus biofilm. Som sådan kan neutrofiler føjes direkte til biofilmen for at vurdere deres aktivering. På den anden side producerer bakterier i biofilm enzymer, såsom katalase og superoxiddismutase for at afgifte ROS23,56. Staphylococcus epidermidis biofilm producerer højere katalase end dets planktoniske modstykke under stress57. Den samlede kemiluminescens af PMA-stimulerede neutrofiler i en S. aureus biofilm er signifikant lavere end de PMA-stimulerede neutrofiler, hvor biofilm er fraværende (figur 2). Dette kan skyldes aktiviteten af disse afgiftende enzymer. Desuden producerer S. aureus biofilm flere poredannende toksiner kaldet leukocidiner, der dræber neutrofiler58. Det reducerede burstrespons skyldes sandsynligvis også neutrofilernes nedsatte levedygtighed i nærværelse af S. aureus biofilm. Mens denne undersøgelse bruger luminol, der detekterer den samlede ROS produceret både inde i og uden for cellerne, skal andre reagenser, såsom CM-H2DCFDA (5-(og-6)-chlormethyl-2’7′-dichlorodihydrofluoresceindiacetat) eller isoluminol, overvejes, hvis målet med arbejdet er at studere intracellulær eller ekstracellulær ROS-produktion14,53,54 specifikt.
Evnen til at visualisere neutrofil-biofilminteraktioner via mikroskopi kan være informativ om neutrofilers og biofilms opførsel i nærværelse af hinanden. Excitations- og emissionsspektrene for fluorescerende farvestoffer og proteiner repræsenterer et øjebliksbillede af interaktionen mellem en 18 timers S. aureus biofilm og neutrofiler efter en 30 minutters inkubation. For effektivt at fange signaler fra farvede celler er det vigtigt at begrænse prøvernes eksponering for lyskilder, mens prøverne opsættes til mikroskopi. Under billeddannelse blev hurtig fotoblegning af prøverne undgået ved at sænke lyskildens intensitet, når alle parametre som Z-stack-højde og eksponeringstid for forskellige kanaler blev justeret.
Denne enkle praksis tillod korrekt mikroskopibilleddannelse, hvor det blev observeret, at få neutrofiler er lokaliseret i biofilmen (figur 4A). Dette kan skyldes mellemrum i biofilmen, da 18 h S. aureus biofilm dyrket i MEMα med 2% glucose ikke dækker overfladen ensartet (figur 4B). Andre undersøgelsers brug af rich media har imidlertid vist en ensartet græsplæne af S. aureus biofilmvækst og leukocytter, der trænger gennem biofilmen30,58. Desuden observeres det også, at der var neutrofil celledød efter 30 minutters inkubation med S. aureus biofilm på grund af S. aureus biofilmproducerede leukocidiner, der lyser neutrofiler58 (figur 4A, D). Tilsætning af et vasketrin for at fjerne ikke-klæbede neutrofiler efter inkubation af dem med biofilm i 30 minutter fjernede ~ 15% af døde neutrofiler fra systemet sammenlignet med den uvaskede gruppe, hvor mikroskopi blev udført umiddelbart efter 30 minutters inkubation (figur 4D). Neutrofiler, der interagerer med S. aureus, blev også observeret (figur 4C). Yderligere eksperimenter er nødvendige for at vurdere, om S. aureus er opslugt af neutrofiler eller bundet til celleoverfladen af neutrofiler54. Imaging neutrofiler og biofilm er det første skridt til at evaluere flere neutrofile funktionaliteter nedstrøms, såsom fagocytose og NETosis54,59. Neutrofilers virkning på biofilm kan også vurderes ved at kvantificere biofilmbiomassen, strukturelle ændringer af biofilmen og biofilmens levedygtighed blandt mange andre ved hjælp af billedanalyseværktøjer, der er anført i trin 5.6. Endelig findes der donor-til-donor-variation i neutrofiler; Det anbefales derfor, at mindst tre forskellige donorer anvendes til undersøgelser, der involverer neutrofiler.
Samlet set blev standardiserede in vitro-assays kombineret for at vurdere interaktioner mellem neutrofiler og biofilm. Selvom disse assays bruger S. aureus, kan de beskrevne protokoller let tilpasses til at studere andre patogener. Mens der er forskellige in vivo-modeller til at studere værtspatogeninteraktioner, kan de være dyre og arbejdskrævende, især hvis forholdene ikke er optimeret. Arbejde med standardiserede in vitro-assays gør det muligt at optimere eksperimentelle forhold og bekræfte observationer, inden man flytter til et in vivo-system. Endelig er forskellige dyreinfektionsmodeller blevet brugt til at studere biofilm-neutrofile interaktioner in vivo. Det er dog vigtigt at overveje immunologiske forskelle mellem mennesker og dyr modeller60,61,62,63. Dette nødvendiggør brug af neutrofiler afledt af mennesker til at studere disse komplekse værtspatogeninteraktioner.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01AI077628) til DJW og en American Heart Association Career Development Award (19CDA34630005) til ESG. Vi takker Dr. Paul Stoodley for at give os USA 300 LAC GFP-stamme. Desuden anerkender vi ressourcer fra Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) og OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), Ohio State University. Vi takker også Amelia Staats, Peter Burback og Lisa Coleman fra Stoodley-laboratoriet for at udføre blodprøver.
0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
Band-aids | Used for blood draw | ||
BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
Hemacytometer | Bright Line | ||
Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
Luminol | Sigma | A8511-5G | |
Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Turnicate | Used for blood draw | ||
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |