Denne protokollen beskriver studiet av nøytrofil-biofilm-interaksjoner. Staphylococcus aureus biofilmer er etablert in vitro og inkuberes med perifere blodavledede humane nøytrofiler. Den oksidative burstresponsen fra nøytrofiler kvantifiseres, og nøytrofillokaliseringen i biofilmen bestemmes ved mikroskopi.
Neutrofiler er den første forsvarslinjen som brukes av immunsystemet under mikrobiell infeksjon. In vivo rekrutteres nøytrofiler til infeksjonsstedet der de bruker prosesser som fagocytose, produksjon av reaktive oksygen- og nitrogenarter (henholdsvis ROS, RNS), NETosis (nøytrofil ekstracellulær felle) og degranulering for å drepe mikrober og løse infeksjonen. Interaksjoner mellom nøytrofiler og planktoniske mikrober har blitt grundig studert. Det har vært nye interesser i å studere infeksjoner forårsaket av biofilm de siste årene. Biofilmer viser egenskaper, inkludert toleranse for drap av nøytrofiler, forskjellig fra deres planktonisk dyrkede kolleger. Med den vellykkede etableringen av både in vitro og in vivo biofilmmodeller, kan interaksjoner mellom disse mikrobielle samfunnene med forskjellige immunceller nå undersøkes. Her er teknikker som bruker en kombinasjon av tradisjonelle biofilmmodeller og veletablerte nøytrofile aktivitetsanalyser skreddersydd spesielt for å studere nøytrofile og biofilminteraksjoner. Bredfeltfluorescensmikroskopi brukes til å overvåke lokalisering av nøytrofiler i biofilmer. Disse biofilmene dyrkes under statiske forhold, etterfulgt av tilsetning av nøytrofiler avledet fra humant perifert blod. Prøvene er farget med passende fargestoffer før visualisering under mikroskopet. I tillegg kvantifiseres produksjonen av ROS, som er en av de mange nøytrofile responsene mot patogener, i nærvær av en biofilm. Tilsetningen av immunceller til dette etablerte systemet vil utvide forståelsen av vertspatogeninteraksjoner samtidig som det sikres bruk av standardiserte og optimaliserte forhold for å måle disse prosessene nøyaktig.
En biofilm er et fellesskap av overflateassosierte mikrober eller ikke-vedlagte aggregater innkapslet i en ekstracellulær polymer substans (EPS)1,2. Disse samfunnene beskytter de innkapslede mikroorganismer mot miljøstressorer, inkludert toleranse for antimikrobielle midler og immunsystemet. Flere patogene mikrobielle arter danner biofilmer som har vært assosiert med kroniske infeksjoner4. Utviklingen av biofilm er en intrikat prosess som involverer festing til overflater, EPS-produksjon, celleproliferasjon, biofilmstrukturering og celleløsning5. Når celler sprer seg for å danne en biofilm, forblir de planktoniske eller translokerer til et nytt substratum og gjenopptar biofilmutvikling6.
Staphylococcus aureus, et opportunistisk patogen, følger en generell ordning for biofilmutvikling, inkludert vedlegg, spredning, modning og spredning7. Festeprosessen i S. aureus biofilmer dikteres av hydrofobe interaksjoner, teichoic syrer og mikrobielle overflatekomponenter som gjenkjenner klebende matrisemolekyler (MSCRAMMs)8,9. Når spredning av S. aureus begynner, produseres EPS, som hovedsakelig består av polysakkarider, proteiner, ekstracellulært DNA og teichoic syrer, 5. Etter hvert som EPS-komponenter produseres, produseres også forskjellige eksoenzymer og små molekyler, noe som bidrar til biofilmens 3-dimensjonale struktur og hjelper til med løsrivelse5. S. aureus utnytter denne svært koordinerte livsstilen for å etablere ulike kroniske infeksjoner, inkludert infeksjoner på grunn av inneboende medisinsk utstyr10.
Meticillinresistent S. aureus (MRSA) er en av de viktigste årsakene til infeksjoner relatert til inneliggende medisinsk utstyr, som sentrale vene- og urinkatetre, proteser, pacemakere, mekaniske hjerteventiler og intrauterin utstyr11. Under slike infeksjoner er nøytrofiler de første vertsimmuncellene som rekrutteres til infeksjonsstedet for å bekjempe patogener via flere strategier12. Disse inkluderer fagocytose, degranulering, produksjon av reaktive oksygen- og nitrogenarter (ROS / RNS), eller frigjøring av nøytrofile ekstracellulære feller (NETs) for å eliminere patogener13.
Generering av ROS ved fagocytose av mikrober er en av de viktigste antimikrobielle responsene som utvises av nøytrofiler14. Fagocytose forsterkes hvis mikrober er belagt med opsoniner, spesielt immunglobuliner og komplementkomponenter som finnes i serum15. De opsoniserte mikrober blir deretter gjenkjent av celleoverflatereseptorer på nøytrofiler og oppslukt, og danner et rom kalt fagosomet15. Nøytrofiler genererer og frigjør ROS i fagosomet via membranassosiert NADPH-oksidase16. Dette multikomponentenzymkomplekset genererer superoksidanioner ved å overføre elektroner til molekylært oksygen16. I tillegg genererer nøytrofiler også RNS gjennom ekspresjon av induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS)17. Disse høye superoksid- og nitrogenoksidradikalene i fagosomet har brede antimikrobielle aktiviteter. De kan samhandle med metallsentre i enzymer og skade nukleinsyrer, proteiner og cellemembraner av patogenet 18,19,20,21. Mange mikrober vedtar en biofilm-livsstil og bruker forskjellige strategier for å unngå drap med ROS22,23. Dermed er standardiserte analyser som par biofilmer med nøytrofiler for å kvantifisere ROS gunstig for konsistente resultater.
Mens analyser, for eksempel kvantifisering av nøytrofil ROS-produksjon, gir informasjon om responsene til nøytrofiler til biofilmer, kan evnen til å visualisere samspillet mellom nøytrofiler i en biofilm også tjene som et kraftig verktøy. Bruken av fluorescerende fargestoffer for mikroskopi krever ofte optimalisering for å oppnå bilder av høy kvalitet som kan brukes til mikroskopiavbildningsanalyse. Fleksibiliteten til å optimalisere noen forhold er begrenset da nøytrofiler kan gjennomgå celledød etter isolasjon. Videre vaskes biofilmer vanligvis for å fjerne den planktoniske populasjonen fra det eksperimentelle oppsettet før tilsetning av nøytrofiler. Under vask kan variabilitet mellom replikerende biofilmer oppstå på grunn av tap av delvis biomasse hvis biofilmer er løst festet til overflaten.
I stor grad inkluderer nåværende metoder i feltet for å analysere interaksjoner mellom nøytrofiler og biofilmer hovedsakelig mikroskopi, flowcytometri og kolonidannende enheter (CFU) oppregning 24,25,26,27. Mikroskopi innebærer bruk av fargestoffer som enten direkte flekker nøytrofile og biofilmer, eller retter seg mot forskjellige nøytrofile responser mot mikrober som NET-dannelse, degranulering og celledød25,28. En undergruppe av disse responsene, som nøytrofil celledød og degranulering, kan også analyseres via flowcytometri, men krever at nøytrofiler fortrinnsvis ikke er assosiert med store mengder mikrober i en biofilm28,29. Flowcytometri kan også kvantifisere noen biofilmparametere, for eksempel cellens levedyktighet27. Disse prosessene krever imidlertid forstyrrelse av biofilmbiomassen og vil ikke være nyttige for å visualisere andre viktige interaksjoner som romlig fordeling av nøytrofiler og deres komponenter i en biofilm27,29,30.
Den nåværende protokollen fokuserer på å tilpasse noen av de tradisjonelt brukte metodene for å studere nøytrofil-biofilminteraksjoner på biofilmer som er optimalisert for å gi minimal variasjon under håndtering. Denne protokollen gir dermed standardiserte metoder for å vokse og kvantifisere biofilmer, isolere primære humane nøytrofiler fra perifert blod, kvantifisere ROS-produksjon og visualisere biofilm-nøytrofile interaksjoner via mikroskopi. Denne protokollen kan tilpasses forskjellige systemer for å forstå biofilm-nøytrofile interaksjoner mens man vurderer heterogeniteten mellom donorbassenger.
Det har vært mange anstrengelser for å vokse robuste og reproduserbare S. aureus biofilmer for nedstrøms eksperimenter in vitro48,49,50. En standardisert protokoll er skissert som utnytter PLLs kationiske natur, samt supplerer media med glukose for vekst av robuste in vitro S. aureus biofilmer. Tilsetningen av PLL muliggjør bedre festing av den negativt ladede bakteriecellen til de positivt ladede PLL-belagte overflatene. Det er viktig å merke seg at PLL ved en konsentrasjon på 10 μg / ml har antimikrobiell aktivitet mot Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli og S. aureus når den inkuberes i 24 timer51. Den samme konsentrasjonen brukes til å belegge overflater; Imidlertid aspireres overflødig PLL, noe som gjør konsentrasjonen av PLL lavere enn 10 μg / ml ved såing for biofilmvekst.
Det er viktig å merke seg at PLL kun har virket i spesifikke vekstmedier som MEMα med 2% glukose, hvor det ble observert at S. aureus produserte robuste biofilmer med minimal variabilitet (figur 2A). PLL-konsentrasjon som skal brukes sammen med andre medietyper vil kreve ytterligere optimalisering, for eksempel bruk av økt konsentrasjon av PLL for å belegge brønnene. I tillegg er disse forholdene optimalisert for en monospecies S. aureus biofilm. Mens kroniske sårbiofilmer ofte er polymikrobielle, er standardiseringsanalyser for å studere monospecies biofilm og dets interaksjoner med nøytrofiler og andre immunceller nøkkelen til å forstå deres bidrag til patogenese52. Disse standardiserte protokollene kan optimaliseres videre for å opprettholde og studere polymikrobielle biofilmer og deres interaksjoner med nøytrofiler.
Det ble også observert at rike bakteriekulturmedier, som TSB, førte til tap av nøytrofil levedyktighet (figur 1). Derfor ble vekstforholdene for S. aureus biofilmer i MEMα, brukt til pattedyrcellekulturer, optimalisert. For studier som involverer nøytrofiler, støtter dette mediet nøytrofil levedyktighet og fremmer S. aureus vekst. Mens det ble observert at media påvirker levedyktigheten til nøytrofiler, er det også viktig å vurdere at nøytrofiler isolert fra perifert humant blod gjennomgår apoptose ex vivo med ca. 70% apoptotiske nøytrofiler innen 20 timer53. Dette krever riktig håndtering, for eksempel lagring av nøytrofile på is når du forbereder eksperimenter, ved bruk av endotoksinfrie reagenser og forhindrer aktivering av nøytrofiler ved å unngå vortexing av prøver med nøytrofiler.
Vurderingen av oksidativt utbrudd i nøytrofiler utføres rutinemessig for å bestemme drapseffekten av nøytrofiler på patogenet14,54,55. Disse studiene utføres ofte med planktoniske bakterier hvor nøytrofiler tilsettes, og den oksidative burstresponsen kvantifiseres ved hjelp av luminolforsterket kjemiluminescens som oppdager superoksidanioner produsert av nøytrofiler. Den nåværende protokollen modifiseres ved å erstatte planktoniske bakterier med statisk dyrket 18 timers S. aureus biofilm. Som sådan kan nøytrofiler legges direkte til biofilmen for å vurdere aktiveringen. På den annen side produserer bakterier i biofilmer enzymer, som katalase og superoksiddismutase for å avgifte ROS23,56. Staphylococcus epidermidis biofilmer produserer høyere katalase enn sin planktoniske motpart under stress57. Den totale kjemiluminescensen av PMA-stimulerte nøytrofiler i en S. aureus-biofilm er signifikant lavere enn de PMA-stimulerte nøytrofile der biofilm er fraværende (figur 2). Dette kan skyldes aktiviteten til disse avgiftende enzymene. Videre produserer S. aureus biofilmer flere poredannende toksiner kalt leukocidiner som dreper nøytrofiler58. Den reduserte burstresponsen skyldes sannsynligvis også den reduserte levedyktigheten til nøytrofiler i nærvær av S. aureus biofilm. Mens denne studien bruker luminol som oppdager den totale ROS produsert både i og utenfor cellene, må andre reagenser, som CM-H 2 DCFDA (5-(og-6)-klormetyl-2’7′-diklordihydrofluorescein diacetat) eller isoluminol, vurderes hvis målet med arbeidet er å studere intracellulær eller ekstracellulær ROS-produksjon14,53,54 spesifikt.
Evnen til å visualisere nøytrofil-biofilm-interaksjoner via mikroskopi kan være informativ om oppførselen til nøytrofiler og biofilmer i nærvær av hverandre. Eksitasjons- og utslippsspektrene til fluorescerende fargestoffer og proteiner representerer et øyeblikksbilde av samspillet mellom en 18 timers S. aureus biofilm og nøytrofiler etter en 30 minutters inkubasjon. For å effektivt fange opp signaler fra fargede celler, er det viktig å begrense eksponeringen av prøvene til lyskilder mens du setter opp prøvene for mikroskopi. Under avbildning ble rask fotobleking av prøvene unngått ved å senke lyskildens intensitet ved justering av alle parametrene som Z-stackhøyde og eksponeringstid for forskjellige kanaler.
Disse enkle praksisene tillot riktig mikroskopiavbildning der det ble observert at få nøytrofiler er lokalisert i biofilmen (figur 4A). Dette kan skyldes mellomrom som er tilstede i biofilmen, da 18 timers S. aureus biofilm dyrket i MEMα med 2% glukose ikke dekker overflaten jevnt (figur 4B). Andre studiers bruk av rike medier har imidlertid vist en ensartet plen av S. aureus biofilmvekst og leukocytter som trenger gjennom biofilmen30,58. Videre er det også observert at det var nøytrofil celledød etter 30 minutters inkubasjon med S. aureus biofilmer på grunn av S. aureus biofilmproduserte leukocidiner som lyse nøytrofiler58 (figur 4A,D). Tilsetning av et vasketrinn for å fjerne ikke-festede nøytrofiler etter inkubering med biofilm i 30 minutter fjernet ~ 15% av døde nøytrofiler fra systemet sammenlignet med den uvaskede gruppen, hvor mikroskopi ble utført umiddelbart etter 30 minutters inkubasjon (figur 4D). Det ble også observert nøytrofiler som interagerer med S. aureus (figur 4C). Ytterligere eksperimenter er nødvendig for å vurdere om S. aureus er oppslukt av nøytrofiler eller festet til celleoverflaten til nøytrofiler54. Imaging nøytrofiler og biofilmer er det første trinnet for å evaluere flere nøytrofile funksjoner nedstrøms, for eksempel fagocytose og NETosis54,59. Effekten av nøytrofiler på biofilm kan også vurderes ved å kvantifisere biofilmbiomassen, strukturelle endringer i biofilmen og biofilmens levedyktighet, blant mange andre, ved hjelp av bildeanalyseverktøy oppført i trinn 5.6. Til slutt eksisterer donor-til-donor-variabilitet i nøytrofiler; Det anbefales derfor at minst tre forskjellige donorer brukes til studier som involverer nøytrofiler.
Samlet sett ble standardiserte in vitro-analyser kombinert for å vurdere interaksjoner mellom nøytrofiler og biofilmer. Selv om disse analysene bruker S. aureus, kan de beskrevne protokollene lett tilpasses for å studere andre patogener. Mens det finnes ulike in vivo-modeller for å studere vertspatogeninteraksjoner, kan de være dyre og arbeidsintensive, spesielt hvis forholdene ikke er optimalisert. Arbeid med standardiserte in vitro-analyser gjør det mulig å optimalisere eksperimentelle forhold og bekrefte observasjoner før man går over til et in vivo-system. Endelig har ulike dyreinfeksjonsmodeller blitt brukt til å studere biofilm-nøytrofile interaksjoner in vivo. Det er imidlertid viktig å vurdere immunologiske forskjeller mellom mennesker og dyremodeller60,61,62,63. Dette nødvendiggjør bruk av nøytrofiler avledet fra mennesker for å studere disse komplekse vertspatogeninteraksjonene.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01AI077628) til DJW og en American Heart Association Career Development Award (19CDA34630005) til ESG. Vi takker Dr. Paul Stoodley for å gi oss USA 300 LAC GFP stamme. Videre anerkjenner vi ressurser fra Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) og OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), Ohio State University. Vi takker også Amelia Staats, Peter Burback og Lisa Coleman fra Stoodley-laboratoriet for å utføre blodtrekk.
0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
Band-aids | Used for blood draw | ||
BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
Hemacytometer | Bright Line | ||
Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
Luminol | Sigma | A8511-5G | |
Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Turnicate | Used for blood draw | ||
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |