O presente protocolo descreve o estudo das interações neutrófilo-biofilme. Os biofilmes de Staphylococcus aureus são estabelecidos in vitro e incubados com neutrófilos humanos derivados do sangue periférico. A resposta de explosão oxidativa dos neutrófilos é quantificada e a localização dos neutrófilos dentro do biofilme é determinada por microscopia.
Os neutrófilos são a primeira linha de defesa implantada pelo sistema imunológico durante a infecção microbiana. In vivo, os neutrófilos são recrutados para o local da infecção, onde usam processos como fagocitose, produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio (ROS, RNS, respectivamente), NETosis (armadilha extracelular de neutrófilos) e degranulação para matar micróbios e resolver a infecção. Interações entre neutrófilos e micróbios planctônicos têm sido extensivamente estudadas. Tem havido interesses emergentes no estudo de infecções causadas por biofilmes nos últimos anos. Os biofilmes exibem propriedades, incluindo tolerância à matança por neutrófilos, distintas de suas contrapartes cultivadas em plâncton. Com o estabelecimento bem-sucedido de modelos de biofilme in vitro e in vivo , as interações entre essas comunidades microbianas com diferentes células imunes podem agora ser investigadas. Aqui, técnicas que usam uma combinação de modelos tradicionais de biofilme e ensaios de atividade de neutrófilos bem estabelecidos são adaptadas especificamente para estudar interações de neutrófilos e biofilmes. A microscopia de fluorescência de campo amplo é usada para monitorar a localização de neutrófilos em biofilmes. Esses biofilmes são cultivados em condições estáticas, seguidos pela adição de neutrófilos derivados do sangue periférico humano. As amostras são coradas com corantes apropriados antes da visualização ao microscópio. Além disso, a produção de EROs, que é uma das muitas respostas de neutrófilos contra patógenos, é quantificada na presença de um biofilme. A adição de células imunes a esse sistema estabelecido expandirá a compreensão das interações hospedeiro-patógeno, garantindo o uso de condições padronizadas e otimizadas para medir esses processos com precisão.
Um biofilme é uma comunidade de micróbios associados à superfície ou agregados não ligados envoltos em uma substância polimérica extracelular (EPS)1,2. Essas comunidades protegem os microrganismos envolvidos de estressores ambientais, incluindo a tolerância a agentes antimicrobianos e ao sistema imunológico3. Várias espécies microbianas patogênicas formam biofilmes que têm sido associados a infecções crônicas4. O desenvolvimento de biofilmes é um processo intrincado que envolve a fixação a superfícies, a produção de EPS, a proliferação celular, a estruturação do biofilme e o descolamento celular5. Uma vez que as células se dispersam para formar um biofilme, elas permanecem planctônicas ou se translocam para um novo substrato e reiniciam o desenvolvimento do biofilme6.
Staphylococcus aureus, um patógeno oportunista, segue um esquema geral de desenvolvimento de biofilme, incluindo fixação, proliferação, maturação e dispersão7. O processo de fixação em biofilmes de S. aureus é ditado por interações hidrofóbicas, ácidos teicóicos e componentes da superfície microbiana que reconhecem moléculas de matriz adesiva (MSCRAMMs)8,9. À medida que a proliferação de S. aureus começa, a EPS, que consiste principalmente em polissacarídeos, proteínas, DNA extracelular e ácidos teicóicos, é produzida5. À medida que os componentes da EPS são produzidos, várias exoenzimas e pequenas moléculas também são produzidas, contribuindo para a estrutura tridimensional do biofilme e auxiliando no descolamento5. S. aureus aproveita esse estilo de vida altamente coordenado para estabelecer várias infecções crônicas, incluindo infecções devido à permanência de dispositivos médicos10.
O S. aureus resistente à meticilina (MRSA) é uma das principais causas de infecções relacionadas a dispositivos médicos de demora, como cateteres venosos e urinários centrais, próteses articulares, marcapassos, valvas cardíacas mecânicas e dispositivos intrauterinos11. Durante essas infecções, os neutrófilos são as primeiras células imunes hospedeiras recrutadas para o local da infecção para combater patógenos por meio de múltiplas estratégias12. Estes incluem fagocitose, degranulação, produção reativa de espécies de oxigênio e nitrogênio (ROS/RNS) ou liberação de armadilhas extracelulares de neutrófilos (TNEs) para eliminar patógenos13.
A geração de EROs na fagocitose de micróbios é uma das principais respostas antimicrobianas exibidas pelos neutrófilos14. A fagocitose é aumentada se os micróbios forem revestidos de opsoninas, particularmente imunoglobulinas e componentes do complemento encontrados no soro15. Os micróbios opsonizados são então reconhecidos pelos receptores da superfície celular nos neutrófilos e engolfados, formando um compartimento chamado fagossomo15. Os neutrófilos geram e liberam EROs no fagossomo através da NADPH-oxidase associada à membrana16. Esse complexo enzimático multicomponente gera ânions superóxidos pela transferência de elétrons para oxigênio molecular16. Além disso, os neutrófilos também geram RNS através da expressão da óxido nítrico sintase induzível (iNOS)17. Esses radicais de alto superóxido e óxido nítrico dentro do fagossomo têm amplas atividades antimicrobianas. Podem interagir com centros metálicos em enzimas e danificar ácidos nucleicos, proteínas e membranas celulares do patógeno 18,19,20,21. Numerosos micróbios adotam um estilo de vida biofilme e empregam diferentes estratégias para evitar a morte por ROS22,23. Assim, ensaios padronizados que acoplam biofilmes com neutrófilos para quantificar ROS são benéficos para resultados consistentes.
Embora os ensaios, como a quantificação da produção de ROS de neutrófilos, forneçam informações sobre as respostas dos neutrófilos aos biofilmes, a capacidade de visualizar as interações dos neutrófilos dentro de um biofilme também pode servir como uma ferramenta poderosa. O uso de corantes fluorescentes para microscopia geralmente requer otimização para obter imagens de alta qualidade que podem ser usadas para análise de imagens microscópicas. A flexibilidade para otimizar algumas condições é limitada, pois os neutrófilos podem sofrer morte celular pós-isolamento. Além disso, os biofilmes são tipicamente lavados para remover a população planctônica da configuração experimental antes da adição de neutrófilos. Durante a lavagem, a variabilidade entre os biofilmes replicados pode surgir devido à perda de biomassa parcial se os biofilmes forem fracamente aderidos à superfície.
Em linhas gerais, os métodos atuais no campo para analisar as interações entre neutrófilos e biofilmes incluem principalmente microscopia, citometria de fluxo e enumeração de unidades formadoras de colônias (UFC)24,25,26,27. A microscopia envolve o uso de corantes que mancham diretamente os neutrófilos e biofilmes, ou visam várias respostas de neutrófilos contra micróbios, como formação de NET, degranulação e morte celular25,28. Um subconjunto dessas respostas, como morte celular de neutrófilos e degranulação, também pode ser analisado por citometria de fluxo, mas requer que os neutrófilos sejam preferencialmente não associados a grandes agregados de micróbios em um biofilme28,29. A citometria de fluxo também pode quantificar alguns parâmetros do biofilme, como a viabilidade celular27. Esses processos, no entanto, requerem ruptura da biomassa do biofilme e não seriam úteis para visualizar outras interações importantes, como a distribuição espacial dos neutrófilos e seus componentes dentro de um biofilme27,29,30.
O presente protocolo se concentra na adaptação de alguns dos métodos tradicionalmente utilizados para estudar as interações neutrófilo-biofilme em biofilmes que foram otimizados para fornecer variabilidade mínima durante o manuseio. Este protocolo, portanto, fornece métodos padronizados para cultivar e quantificar biofilmes, isolar neutrófilos humanos primários do sangue periférico, quantificar a produção de ROS e visualizar interações biofilme-neutrófilo via microscopia. Este protocolo pode ser adaptado a diferentes sistemas para entender as interações biofilme-neutrófilo, considerando a heterogeneidade entre os grupos de doadores.
Tem havido inúmeros esforços para cultivar biofilmes robustos e reprodutíveis de S. aureus para experimentos a jusante in vitro48,49,50. É delineado um protocolo padronizado que aproveita a natureza catiônica do PLL, bem como a suplementação do meio com glicose para o crescimento de biofilmes robustos de S. aureus in vitro. A adição de PLL permite uma melhor fixação da célula bacteriana carregada negativamente às superfícies revestidas de PLL carregadas positivamente. É importante notar que a LLC em uma concentração de 10 μg/mL tem atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e S. aureus quando incubada por 24 h51. A mesma concentração é usada para revestir superfícies; no entanto, o excesso de PLL é aspirado, tornando a concentração de PLL inferior a 10 μg/mL ao semear para o crescimento do biofilme.
É importante ressaltar que a LPA tem atuado apenas em meios de crescimento específicos, como o MEMα com glicose a 2%, onde foi observado que S. aureus produziu biofilmes robustos com variabilidade mínima (Figura 2A). A concentração de PLL a ser usada em conjunto com outros tipos de meios exigiria otimização adicional, como o uso de uma concentração aumentada de PLL para revestir os poços. Além disso, essas condições foram otimizadas para um biofilme de S. aureus monoespécie. Embora os biofilmes de feridas crônicas sejam frequentemente polimicrobianos, a padronização de ensaios para estudar o biofilme de monoespécies e suas interações com neutrófilos e outras células imunes é fundamental para entender sua contribuição para a patogênese52. Esses protocolos padronizados podem ser otimizados ainda mais para sustentar e estudar biofilmes polimicrobianos e suas interações com neutrófilos.
Observou-se também que meios de cultura bacteriana ricos, como o TSB, levaram à perda da viabilidade dos neutrófilos (Figura 1). Portanto, as condições de crescimento dos biofilmes de S. aureus em MEMα, utilizados para culturas de células de mamíferos, foram otimizadas. Para estudos envolvendo neutrófilos, este meio suporta a viabilidade dos neutrófilos e promove o crescimento de S. aureus. Embora tenha sido observado que a mídia afeta a viabilidade dos neutrófilos, também é importante considerar que os neutrófilos isolados do sangue humano periférico sofrem apoptose ex vivo com aproximadamente 70% de neutrófilos apoptóticos até 20 h53. Isso requer manuseio adequado, como armazenar os neutrófilos no gelo ao se preparar para experimentos, usar reagentes livres de endotoxinas e prevenir a ativação de neutrófilos, evitando o vórtice de amostras com neutrófilos.
A avaliação da explosão oxidativa em neutrófilos é realizada rotineiramente para determinar o efeito de morte dos neutrófilos sobre o patógeno14,54,55. Esses estudos são frequentemente realizados com bactérias planctônicas, onde os neutrófilos são adicionados, e a resposta de explosão oxidativa é quantificada usando quimioluminescência amplificada por luminol que detecta ânions superóxido produzidos por neutrófilos. O presente protocolo é modificado pela substituição de bactérias planctônicas por biofilme de S. aureus de 18 h cultivado estaticamente. Como tal, os neutrófilos podem ser adicionados diretamente ao biofilme para avaliar sua ativação. Por outro lado, bactérias em biofilmes produzem enzimas, como catalase e superóxido dismutase para desintoxicar ROS23,56. Os biofilmes de Staphylococcus epidermidis produzem maior catalase do que sua contraparte planctônica sob estresse57. A quimioluminescência total de neutrófilos estimulados por PMA em um biofilme de S. aureus é significativamente menor do que a dos neutrófilos estimulados por PMA, onde o biofilme está ausente (Figura 2). Isso pode ser devido à atividade dessas enzimas desintoxicantes. Além disso, os biofilmes de S. aureus produzem várias toxinas formadoras de poros chamadas leucocidinas que matam os neutrófilos58. A resposta reduzida à explosão também é provavelmente devido à viabilidade reduzida de neutrófilos na presença de biofilme de S. aureus. Embora este estudo utilize luminol que detecta as EROs totais produzidas dentro e fora das células, outros reagentes, como o CM-H 2 DCFDA (5-(e-6)-clorometil-2’7‘-diacetato de diclorodihidrofluoresceína) ou o isoluminol, precisam ser considerados se o objetivo do trabalho é estudar a produção de ERO intracelular ou extracelular14,53,54 especificamente.
A capacidade de visualizar interações neutrófilo-biofilme via microscopia pode ser informativa sobre o comportamento de neutrófilos e biofilmes na presença um do outro. Os espectros de excitação e emissão dos corantes e proteínas fluorescentes representam um instantâneo da interação entre um biofilme de S. aureus de 18 h e neutrófilos após uma incubação de 30 minutos. Para capturar efetivamente os sinais das células coradas, é importante limitar a exposição das amostras a fontes de luz ao configurar as amostras para microscopia. Durante a imagem, o fotobranqueamento rápido das amostras foi evitado, diminuindo a intensidade da fonte de luz ao ajustar todos os parâmetros, como a altura da pilha Z e o tempo de exposição para diferentes canais.
Essas práticas simples permitiram a microscopia adequada, onde foi observado que poucos neutrófilos estão localizados dentro do biofilme (Figura 4A). Isso pode ser devido aos espaços presentes no biofilme, pois o biofilme de 18 h de S. aureus cultivado em MEMα com glicose a 2% não cobre uniformemente a superfície (Figura 4B). No entanto, o uso de meios ricos por outros estudos mostrou um gramado uniforme de crescimento de biofilme de S. aureus e leucócitos penetrando através do biofilme30,58. Além disso, observa-se também que houve morte celular de neutrófilos após 30 min de incubação com biofilmes de S. aureus devido a leucocidinas produzidas por biofilme de S. aureus que lisam neutrófilos58 (Figura 4A,D). A adição de uma etapa de lavagem para remoção de neutrófilos não aderidos após incubá-los com biofilme por 30 min removeu ~15% dos neutrófilos mortos do sistema em comparação com o grupo não lavado, no qual a microscopia foi realizada imediatamente após 30 min de incubação (Figura 4D). Neutrófilos interagindo com S. aureus também foram observados (Figura 4C). Mais experimentos são necessários para avaliar se o S. aureus é engolido por neutrófilos ou ligado à superfície celular dos neutrófilos54. A imagem de neutrófilos e biofilmes é o primeiro passo para avaliar várias funcionalidades de neutrófilos a jusante, como fagocitose e NETosis54,59. O efeito dos neutrófilos sobre os biofilmes também pode ser avaliado quantificando a biomassa do biofilme, as mudanças estruturais do biofilme e a viabilidade do biofilme, entre muitas outras, utilizando ferramentas de análise de imagens listadas na etapa 5.6. Por último, existe uma variabilidade doador-doador nos neutrófilos; assim, recomenda-se que pelo menos três doadores diferentes sejam utilizados para estudos envolvendo neutrófilos.
No geral, ensaios in vitro padronizados foram combinados para avaliar as interações entre neutrófilos e biofilmes. Embora esses ensaios utilizem S. aureus, os protocolos descritos podem ser facilmente adaptados para estudar outros patógenos. Embora existam vários modelos in vivo para estudar as interações hospedeiro-patógeno, eles podem ser caros e trabalhosos, especialmente se as condições não forem otimizadas. Trabalhar com ensaios in vitro padronizados permite otimizar as condições experimentais e confirmar as observações antes de passar para um sistema di vivo. Finalmente, vários modelos de infecção animal têm sido usados para estudar as interações biofilme-neutrófilo in vivo. No entanto, é importante considerar as diferenças imunológicas entre humanos e modelos animais60,61,62,63. Isso requer o uso de neutrófilos derivados de humanos para estudar essas complexas interações hospedeiro-patógeno.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi financiado pelo Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas (R01AI077628) para DJW e um Prêmio de Desenvolvimento de Carreira da American Heart Association (19CDA34630005) para ESG. Agradecemos ao Dr. Paul Stoodley por nos fornecer a cepa USA 300 LAC GFP. Além disso, reconhecemos os recursos do Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) e do OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), da Ohio State University. Também agradecemos a Amelia Staats, Peter Burback e Lisa Coleman, do laboratório Stoodley, pela realização de coletas de sangue.
0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
Band-aids | Used for blood draw | ||
BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
Hemacytometer | Bright Line | ||
Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
Luminol | Sigma | A8511-5G | |
Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Turnicate | Used for blood draw | ||
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |