Isolering, kultur og karakterisering af primære Schwann-celler, keratinocytter og fibroblaster fra human forhud
Summary
Undersøgelsen af sårheling forbundet med muskuloskeletal skade kræver ofte vurdering af in vitro-interaktioner mellem Schwann-celler (SC’er), keratinocytter og fibroblaster. Denne protokol beskriver isolering, dyrkning og karakterisering af disse primære celler fra den menneskelige forhud.
Abstract
Denne protokol beskriver isolationsmetoder, dyrkningsbetingelser og karakterisering af humane primære celler med højt udbytte og levedygtighed ved hjælp af hurtig enzymatisk dissociation af huden. Primære keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler høstes alle fra den menneskelige nyfødte forhud, som er tilgængelig efter standardplejeprocedurer. Den fjernede hud desinficeres, og det subkutane fedt og muskler fjernes ved hjælp af en skalpel. Metoden består af enzymatisk og mekanisk adskillelse af epidermale og dermale lag efterfulgt af yderligere enzymatisk fordøjelse for at opnå enkeltcellesuspensioner fra hvert af disse hudlag. Endelig dyrkes enkeltceller i passende cellekulturmedier efter standard cellekulturprotokoller for at opretholde vækst og levedygtighed over uger. Sammen tillader denne enkle protokol isolering, dyrkning og karakterisering af alle tre celletyper fra et enkelt stykke hud til in vitro-evaluering af hudnervemodeller. Derudover kan disse celler bruges sammen i co-kulturer til at måle deres virkninger på hinanden og deres reaktioner på in vitro-traumer i form af ridser udført robotisk i kulturen forbundet med sårheling.
Introduction
Primære celler afledt af levende væv og dyrket under in vitro-forhold ligner meget den fysiologiske tilstand1, hvilket gør dem til en ideel model til undersøgelse af fysiologiske og patofysiologiske processer. Huden indeholder flere celletyper, herunder keratinocytter, fibroblaster, sebocytter, melanocytter og Schwann-celler (SC’er), som kan isoleres og dyrkes til in vitro-eksperimenter . Metoder til at isolere og dyrke keratinocytter, fibroblaster og SC’er fra et enkelt stykke hud er ikke beskrevet. Målet med denne protokol er todelt: 1) at etablere en pålidelig og reproducerbar metode til isolering og dyrkning af dermaleSC’er og 2) at anvende en effektiv, robust metode til isolering af keratinocytter, fibroblaster og SC’er fra en enkelt menneskelig forhud.
På nuværende tidspunkt er der etablerede protokoller til isolering af hudkeratinocytter 2,3,4 og fibroblaster 5,6. Disse undersøgelser beskriver isoleringen af enten keratinocytter, fibroblaster eller begge dele fra huden, men ingen protokol omhandler, hvordan man etablerer kulturer af primære SC’er fra menneskelig hud. Nylige undersøgelser tyder på, at neuronale SC’er modulerer keratinocyt- og fibroblastcellulære processer og regulerer normale hudfysiologiske funktioner7. SC’er er således kritiske for hudens homeostase og bidrager væsentligt til den regulerende fysiologi, der påvirker adfærden hos de nærliggende hudcelletyper, der er til stede8. Derfor er en protokol, der muliggør isolering af hver af disse celletyper, ideel til in vitro-eksperimenter, der involverer celle-cellekommunikation eller krydstale mellem celletyper.
Denne protokol beskriver etableringen af individuelle cellekulturer af primære celler fra et enkelt stykke hud. Denne protokol er især nyttig, når mængden af tilgængeligt væv er begrænset. Desuden giver isolering af alle tre celletyper fra en enkelt donor mulighed for robuste sammenligninger mellem celletyper eller co-kulturforsøg, samtidig med at genetikkens indflydelse mindskes under det ønskede eksperiment.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol beskriver en metode til at isolere tre forskellige cellepopulationer fra et enkelt stykke af forhuden, nemlig keratinocytter, fibroblaster og Schwann-celler. Der er et par isolationsprotokoller til rådighed for at isolere keratinocytter og fibroblaster 2,3,5,6, men ingen beskriver SC-isolering. Bortset fra de vigtigste strukturelle celler i hud, keratinocytter og fibroblaster er…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Dr. Fadia Kamal og Dr. Reyad Elbarbary for at give os mulighed for at bruge laboratorieinstrumenter og teknisk support. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra NIH (K08 AR060164-01A) og DOD (W81XWH-16-1-0725) til J. C. E. ud over institutionel støtte fra Pennsylvania State University Hershey Medical Center.
Materials
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
Riferimenti
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
