अलगाव, संस्कृति, और प्राथमिक श्वान कोशिकाओं, केराटिनोसाइट्स, और मानव चमड़ी से Fibroblasts के लक्षण वर्णन
Summary
मस्कुलोस्केलेटल चोट से जुड़े घाव भरने के अध्ययन के लिए अक्सर श्वान कोशिकाओं (एससी), केराटिनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट्स के बीच इन विट्रो इंटरैक्शन के मूल्यांकन की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल मानव चमड़ी से इन प्राथमिक कोशिकाओं के अलगाव, खेती और लक्षण वर्णन का वर्णन करता है।
Abstract
यह प्रोटोकॉल अलगाव विधियों, खेती की स्थिति, और त्वचा के तेजी से एंजाइमेटिक पृथक्करण का उपयोग करके उच्च उपज और व्यवहार्यता के साथ मानव प्राथमिक कोशिकाओं के लक्षण वर्णन का वर्णन करता है। प्राथमिक केराटिनोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स और श्वान कोशिकाएं सभी मानव नवजात चमड़ी से काटी जाती हैं, जो देखभाल प्रक्रियाओं के मानक के बाद उपलब्ध है। हटाई गई त्वचा को कीटाणुरहित किया जाता है, और चमड़े के नीचे की वसा और मांसपेशियों को एक स्केलपेल का उपयोग करके हटा दिया जाता है। विधि में एपिडर्मल और त्वचीय परतों के एंजाइमेटिक और यांत्रिक अलगाव होते हैं, इसके बाद इन त्वचा परतों में से प्रत्येक से एकल-सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त एंजाइमेटिक पाचन होता है। अंत में, एकल कोशिकाओं को हफ्तों में विकास और व्यवहार्यता बनाए रखने के लिए मानक सेल संस्कृति प्रोटोकॉल का पालन करते हुए उपयुक्त सेल संस्कृति मीडिया में उगाया जाता है। साथ में, यह सरल प्रोटोकॉल त्वचा-तंत्रिका मॉडल के इन विट्रो मूल्यांकन के लिए त्वचा के एक टुकड़े से सभी तीन सेल प्रकारों के अलगाव, खेती और लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, इन कोशिकाओं का उपयोग सह-संस्कृतियों में एक साथ किया जा सकता है ताकि एक-दूसरे पर उनके प्रभावों का पता लगाया जा सके और घाव भरने से जुड़ी संस्कृति में रोबोटिक रूप से किए गए खरोंच के रूप में इन विट्रो आघात के लिए उनकी प्रतिक्रियाएं।
Introduction
जीवित ऊतक से व्युत्पन्न प्राथमिक कोशिकाएं और इन विट्रो स्थितियों के तहत सुसंस्कृत शारीरिक स्थिति1 के समान हैं, जिससे उन्हें शारीरिक और pathophysiological प्रक्रियाओं की जांच के लिए एक आदर्श मॉडल बना दिया जाता है। त्वचा में केराटिनोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स, सेबोसाइट्स, मेलानोसाइट्स और श्वान कोशिकाओं (एससी) सहित कई सेल प्रकार होते हैं, जिन्हें इन विट्रो प्रयोगों के लिए अलग और सुसंस्कृत किया जा सकता है। त्वचा के एक टुकड़े से केराटिनोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स और एससी को अलग करने और संस्कृति करने के तरीकों का वर्णन नहीं किया गया है। इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य दोगुना है: 1) त्वचीय एससी के अलगाव और खेती के लिए एक विश्वसनीय और पुन: प्रस्तुत करने योग्य विधि स्थापित करने के लिए और 2) एक ही मानव चमड़ी से केराटिनोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स और एससी के अलगाव के लिए एक कुशल, मजबूत विधि का उपयोग करने के लिए।
वर्तमान में, त्वचा केराटिनोसाइट्स 2,3,4 और फाइब्रोब्लास्ट्स 5,6 को अलग करने के लिए स्थापित प्रोटोकॉल हैं। ये अध्ययन या तो केराटिनोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स, या त्वचा से दोनों के अलगाव का वर्णन करते हैं, लेकिन कोई प्रोटोकॉल मानव त्वचा से प्राथमिक एससी की संस्कृतियों को स्थापित करने के तरीके को संबोधित नहीं करता है। हाल के अध्ययनों से पता चलता है कि न्यूरोनल एससी केराटिनोसाइट और फाइब्रोब्लास्ट सेलुलर प्रक्रियाओं को संशोधित करते हैं और सामान्य त्वचा शारीरिक कार्यों को विनियमित करतेहैं। एससी इस प्रकार त्वचा होमोस्टैसिस के लिए महत्वपूर्ण हैं और शरीर विज्ञान को विनियमित करने में काफी योगदान देते हैं जो पड़ोसी त्वचा सेल प्रकारों के व्यवहार को प्रभावित करताहै। इसलिए, एक प्रोटोकॉल जो इन सेल प्रकारों में से प्रत्येक के अलगाव के लिए अनुमति देता है, सेल-सेल संचार या सेल प्रकारों के बीच क्रॉस-टॉक से जुड़े इन विट्रो प्रयोगों के लिए आदर्श है।
यह प्रोटोकॉल त्वचा के एक टुकड़े से प्राथमिक कोशिकाओं की व्यक्तिगत कोशिका संस्कृतियों की स्थापना का वर्णन करता है। यह प्रोटोकॉल विशेष रूप से उपयोगी होता है जब उपलब्ध ऊतक की मात्रा सीमित होती है। इसके अलावा, एक एकल दाता से सभी तीन सेल प्रकारों का अलगाव वांछित प्रयोग के दौरान आनुवांशिकी के प्रभाव को कम करते हुए सेल प्रकारों या सह-संस्कृति प्रयोगों के बीच मजबूत तुलना के लिए अनुमति देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह प्रोटोकॉल चमड़ी के एक टुकड़े से तीन अलग-अलग सेल आबादी को अलग करने की एक विधि का वर्णन करता है, अर्थात् केराटिनोसाइट्स, फाइब्रोब्लास्ट्स और श्वान कोशिकाएं। केराटिनोसाइट्स और फाइब्रोब्लास्ट्स <s…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हमें प्रयोगशाला उपकरणों और तकनीकी सहायता का उपयोग करने की अनुमति देने के लिए डॉ फाडिया कमल, और डॉ रेयाद एल्बरबेरी को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को एनआईएच (K08 AR060164-01A) और DOD (W81XWH-16-1-0725) से पेंसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी हर्शे मेडिकल सेंटर से संस्थागत समर्थन के अलावा जे.सी. ई. से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
Riferimenti
- Hawksworth, G. M. Advantages and disadvantages of using human cells for pharmacological and toxicological studies. Human & Experimental Toxicology. 13 (8), 568-573 (1994).
- Green, H., Kehinde, O., Thomas, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (11), 5665-5668 (1979).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Aasen, T., Izpisua Belmonte, J. C. Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature Protocols. 5 (2), 371-382 (2010).
- Seluanov, A., Vaidya, A., Gorbunova, V. Establishing primary adult fibroblast cultures from rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2033 (2010).
- Belviso, I., et al. Isolation of adult human dermal fibroblasts from abdominal skin and generation of induced pluripotent stem cells using a non-integrating method. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (155), e60629 (2020).
- Silva, W. N., et al. Role of Schwann cells in cutaneous wound healing. Wound Repair and Regeneration. 26 (5), 392-397 (2018).
- Bray, E. R., Cheret, J., Yosipovitch, G., Paus, R. Schwann cells as underestimated, major players in human skin physiology and pathology. Experimental Dermatology. 29 (1), 93-101 (2020).
- Laverdet, B., et al. Skin innervation: important roles during normal and pathological cutaneous repair. Histology and Histopathology. 30 (8), 875-892 (2015).
- Jessen, K. R., Mirsky, R., Lloyd, A. C. Schwann cells: Development and role in nerve repair. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (7), 020487 (2015).
- Bentley, C. A., Lee, K. F. p75 is important for axon growth and Schwann cell migration during development. The Journal of Neuroscience. 20 (20), 7706-7715 (2000).
- Rutkowski, J. L., et al. Signals for proinflammatory cytokine secretion by human Schwann cells. Journal of Neuroimmunology. 101 (1), 47-60 (1999).
- Kumar, A., Brockes, J. P. Nerve dependence in tissue, organ, and appendage regeneration. Trends in Neurosciences. 35 (11), 691-699 (2012).
- Balakrishnan, A., et al. Insights into the role and potential of Schwann cells for peripheral nerve repair from studies of development and injury. Frontiers in Molecular Neuroscience. 13, 608442 (2020).
- Gresset, A., et al. Boundary caps give rise to neurogenic stem cells and terminal glia in the skin. Stem Cell Reports. 5 (2), 278-290 (2015).
- Stratton, J. A., et al. Purification and characterization of Schwann cells from adult human skin and nerve. eNeuro. 4 (3), (2017).
