인간 포피로부터의 일차 슈완 세포, 각질세포 및 섬유아세포의 분리, 배양 및 특성화
Summary
근골격계 손상과 관련된 상처 치유에 대한 연구는 종종 슈완 세포 (SC), 각질 세포 및 섬유 아세포 간의 시험관 내 상호 작용의 평가를 필요로합니다. 이 프로토콜은 인간 포피로부터 이들 일차 세포의 분리, 배양 및 특성화를 기술한다.
Abstract
이 프로토콜은 피부의 신속한 효소 해리를 사용하여 높은 수율과 생존력을 가진 인간 일차 세포의 분리 방법, 배양 조건 및 특성화를 설명합니다. 일차 각질세포, 섬유아세포, 슈완 세포는 모두 인간 신생아 포피로부터 수확되며, 이는 표준 관리 절차에 따라 사용할 수 있습니다. 제거 된 피부는 소독되고 피하 지방과 근육은 메스를 사용하여 제거됩니다. 이 방법은 표피 및 진피 층의 효소 및 기계적 분리로 구성되며, 이어서 추가적인 효소 소화가 이뤄져 이들 피부 층 각각으로부터 단일 세포 현탁액을 얻는다. 마지막으로, 단일 세포는 표준 세포 배양 프로토콜에 따라 적절한 세포 배양 배지에서 성장하여 수주에 걸쳐 성장 및 생존력을 유지한다. 함께, 이 간단한 프로토콜은 피부-신경 모델의 시험관내 평가를 위해 단일 피부 조각으로부터 세 가지 세포 유형 모두를 분리, 배양 및 특성화할 수 있게 한다. 추가적으로, 이들 세포는 상처 치유와 관련된 배양물에서 로봇적으로 수행되는 스크래치의 형태로 서로에 대한 그들의 영향 및 시험관내 외상에 대한 그들의 반응을 측정하기 위해 공동 배양물에서 함께 사용될 수 있다.
Introduction
생체 조직으로부터 유래되고 시험관내 조건 하에서 배양된 1차 세포는 생리학적 상태1과 매우 유사하여, 이들을 생리학적 및 병리생리학적 과정을 조사하기 위한 이상적인 모델이다. 피부는 각질세포, 섬유아세포, 세포세포, 멜라노사이트 및 슈완 세포(SCs)를 포함하는 다수의 세포 유형을 함유하며, 이는 시험관내 실험을 위해 단리되고 배양될 수 있다. 피부의 단일 조각으로부터 각질세포, 섬유아세포 및 SCs를 분리하고 배양하는 방법은 기술되지 않았다. 이 프로토콜의 목표는 두 가지입니다 : 1) 진피 SC의 분리 및 배양을위한 신뢰할 수 있고 재현 가능한 방법을 확립하고 2) 단일 인간 포피에서 각질 세포, 섬유 아세포 및 SC를 분리하기위한 효율적이고 강력한 방법을 사용하는 것입니다.
현재, 피부 각질세포 2,3,4 및 섬유아세포 5,6을 분리하기 위한 확립된 프로토콜이 있다. 이 연구는 피부로부터 각질세포, 섬유아세포 또는 둘 다의 분리를 기술하지만, 인간 피부로부터 일차 SC의 배양을 확립하는 방법을 다루는 프로토콜은 없다. 최근 연구에 따르면 뉴런 SC는 각질세포 및 섬유아세포 세포 과정을 조절하고 정상적인 피부 생리적 기능을 조절한다7. 따라서 SCs는 피부 항상성에 매우 중요하며, 존재하는 이웃 피부 세포 유형의 거동에 영향을 미치는 생리학을 조절하는데 실질적으로 기여한다8. 따라서, 이들 세포 유형 각각의 단리를 허용하는 프로토콜은 세포-세포 유형 간의 통신 또는 교차 대화를 포함하는 시험관내 실험에 이상적이다.
이 프로토콜은 피부의 단일 조각으로부터 일차 세포의 개별 세포 배양의 확립을 기술한다. 이러한 프로토콜은 사용 가능한 조직의 양이 제한될 때 특히 유용하다. 또한, 단일 공여체로부터 세 가지 세포 유형을 모두 분리하면 원하는 실험 중에 유전학의 영향을 완화하면서 세포 유형 또는 공동 배양 실험 간의 강력한 비교가 가능합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 포피의 단일 조각, 즉 각질세포, 섬유아세포 및 슈완 세포로부터 세 개의 별개의 세포 집단을 분리하는 방법을 기술한다. 각질세포 및 섬유아세포2,3,5,6을 분리하는데 이용가능한 몇 가지 분리 프로토콜이 있지만, SC 단리를 기술하는 것은 없다. 피부, 각질세포 및 섬유아세포의 주요 구…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 Fadia Kamal 박사와 실험실 장비 및 기술 지원을 사용할 수있게 해준 Reyad Elbarbary 박사에게 감사드립니다. 이 작업은 펜실베니아 주립 대학 허쉬 메디컬 센터의 기관 지원 외에도 NIH (K08 AR060164-01A) 및 DOD (W81XWH-16-1-0725)의 보조금으로 J. C. E.에 지원되었습니다.
Materials
| 0.22 µM sterile filters (Millex-GP Syringe Filter Unit,polyethersulfone) | MilliporeSigma | SLGPR33RS | |
| 70 µM cell strainers | CELLTREAT | 229483 | |
| 100 µM cell strainers | CELLTREAT | 229485 | |
| 1 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD-309659 | |
| 5 mL disposable syringes (Syringe sterile, single use) | BD Luer-Lok | BD309646 | |
| 10 mL disposable syringes | BD Luer-Lok | BD305462 | |
| 1% TritonX-100 | Sigma | X100-1L | Prepared at the time of use |
| 4% paraformaldehyde solution | ThermoFisher Scientific | J19943.K2 | Ready to use and store at 4 °C |
| 5% BSA | Sigma | A7906-100G | Prepared at the time of use |
| 70% ethanol | Pharmco | 111000200 | |
| Antibiotic | ScienCell Research | 503 | |
| Chemometec Vial1-Cassette | Fisher Scientific | NC1420193 | |
| Collagenase | Gibco | 17018-029 | |
| Coverslip | Fisherbrand | 12544D 22*50-1.5 | |
| Dispase I | Sigma-Aldrich | D46693 | |
| DMEM basal medium | ScienCell Research | 9221 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline free from Ca2+ and Mg2+ (DPBS) | Corning | 21-031-CV) | |
| Nunc 15 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339651 | |
| Nunc 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339653 | |
| 1.5 mL micro-centrifuge tubes | Fisherbrand | 02-681-5 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | ThermoFisher Scientific | 10082147 | |
| Fibroblast complete medium | ScienCell Research | 2331 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11032 | Dilution (1:500) |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11008 | Dilution (1:500) |
| Hanks' Buffered Saline Solution (HBSS buffer) | Lonza | CC-5022 | |
| Human foreskin | De-identified human foreskin tissue for research purposes (Institutional Review Board- IRB #17574). | ||
| KGM-GOLD keratinocyte medium (KGM gold and supplements) | Lonza | 00192151 and 00192152 | |
| Mouse alpha-smooth muscle actin antibody | ThermoFisher Scientific | 14-9760-82 | Dilution (1:200) |
| Mouse Cytokeratin14 antibody | Abcam | ab7800 | Dilution (1:100) |
| Mouse S100 antibody | ThermoFisher Scientific | MA5-12969 | Dilution (1:200) |
| Multi chambered (4 well glass slide) | Tab-Tek | 154526 | |
| NucleoCounter -Via1-Cassette | Chemometec | 941-0012 | |
| Poly-L-Lysisne (PLL) | ScienCell Research | 32503 | |
| ProLong Gold Anti-fade Mountant with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
| Rabbit K10 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4501656 | Dilution (1:100) |
| Rabbit p75-NTR antibody | Millipore | AB1554 | Dilution (1:500) |
| Rabbit vimentin | ProteinTech | 10366-1-AP | Dilution (1:200) |
| Schwann cell culture medium | ScienCell Research | 1701 | |
| Precision tweezers DUMONT straight with extra fine tips Dumostar, 5 | ROTH | LH75.1 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| IRIS Scissors, sharp/sharp. Length 4–3/8"(111mm) | Codman | 54-6500 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| Sterilized surgical – sharp blade (Duro Edge Economy Single Edge Blades) | Razor blade company | 94-0120 | Sterilize with 70% alcohol before use |
| T25 culture flask | Corning | 353109 | |
| Trypsin neutralization buffer (TNS) | Lonza | CC-5002 | |
| Trypsin/EDTA | Lonza | CC-5012 | |
| Inverted microscope | ZEISS | Axio Observer 7- Axiocam 506 mono – Apotome.2 microscope | For immunofluorescence of chamber slide containing stained cells |
| Inverted microscope | ZEISS | Primovert | For visulaizing/observing cell attachment or detachment |
Riferimenti
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